中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究

目的　运用分子标记技术鉴定药材蛇胆的真伪,以克服目前仅依据形态、显微特征及理化性状进行鉴别的不足。方法　分别从药材蛇胆的胆衣和胆汁、原动物棕黑锦蛇的肌肉和胆汁中提取DNA,经PCR扩增得到约400bp的12SrRNA基因片段,并对该基因片段进行测序研究。结果　从少量药材蛇胆的胆衣和胆汁中可提得足够用于PCR扩增的DNA模板,扩增产物的测序结果表明同一动物的胆衣和胆汁、肌肉和胆汁的碱基序列完全一致。结论　DNA分子标记技术可用于中药材蛇胆和胆汁的鉴定,提示该技术也可用于其他动物分泌物类型药材的鉴别。目前市场上药材蛇胆来源较复杂,需加强质量监督和控制。     

中药材龟甲的分子鉴定研究

用PCR产物直接测序法对中药材龟甲(板)进行鉴别。从乌龟 Chinemys revesii 和其他20种产地为中国或东南亚国家的龟类的组织材料中提取DNA,扩增约110bp的线粒体12SrRNA,基因片段并进行序列分析,构建了21种龟类的12SrRNA基因片段序列数据库。序列比较的结果表明乌龟与其它20种龟类的这段序列均有差别,序列差异在3.7～15.7%之间。从江苏省药品检验所提供的19块龟甲检品上各取样0.1～0.5g提取 DNA,扩增与上述相同的基因片段,与构建的数据库进行比较,结果表明19块龟甲中只有3块的原动物为乌龟,其余的龟甲均为混淆品。本文的结果为药材龟甲的鉴定找到了有效、可靠的分子遗传标记方法。     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

现代生物技术在中药鉴定方面的应用及前景

近几年,在分子生物学领域中,DNA分子遗传标记(DNAMoleuclar Gene-tic Marker)技术迅猛发展,新方法、新技术不断涌现。继同工酶(isozyme)、 RFLP (Restriction FragmentLength Polymorphi - sm)和DNA指纹(DNA fingerprinting)技术以后,90年代又发展了RAPD(Random Amplifed Polymor-phic DNA)、CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)、AFLP(AmPlified Fragment Length Polymorphic)技术等,它们已越来越多地用于药材品种鉴别的研究。在已有的研究报道中使用的鉴别方法可归为三类：(1)基于PCR反应的方法,包括RAPD、AP-PCR、微卫星DNA等;(2)限制性片段长度多态性和PCR产物的RFLP分析(PCR-RFLP);(3)DNA测序,已报道了5SrRNA间隔区、ITSI、ITS2、Cytb和12S rRNA等基因片段的序列分析。以下对在中药材品种鉴别中应用较多的RAPD和高特异性PCR鉴别技术作一简单介绍。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cytb基因全序列分析的基础上 ,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu0 1 L和ILu0 1 H。结果　在 6 4℃的复性温度下 ,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约 36 5bp阳性扩增带 ;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定 ,结果表明 :3批鹿茸仅一批为正品 ,2批鹿鞭皆为伪品 ,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取 2枚鹿茸及一个原动物做Cytb基因片段序列分析 ,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性 ,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

冬虫夏草特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种准确、简便的方法鉴别冬虫夏草真伪。方法采用改良CTAB法从冬虫夏草样品中提取总DNA,根据r DNA中ITS1区序列设计一对特异性引物,对虫草样品进行特异性扩增。结果冬虫夏草标准品和部分市售虫草样品能扩增出255bp大小的目的片段,其余虫草样品未能扩增出相应条带。结论改良CTAB法提取DNA所需时间短对DNA分子破坏性小。特异PCR鉴别冬虫夏草真伪的方法准确快捷,对珍贵药材的甄别具有广阔的前景。     

MPCR技术对三种带绦虫的快速鉴别

目的用带绦虫HDP2基因片段对云南省所存在的猪带绦虫、亚洲带绦虫、牛带绦虫进行快速鉴别。方法选取云南省怒江、大理、香格里拉、保山四地区带绦虫成虫孕节片提取基因组DNA,进行MPCR扩增HDP2基因片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测与标准株对比。结果 12株来自云南省怒江、大理、香格里拉、保山四地区带绦虫MPCR均扩增出约600bp和389bp的产物,与亚洲带绦虫标准株所扩增出的条带一致。结论 MPCR扩增特异性的HDP2基因片段可快速鉴别三种带绦虫。     

三角帆蚌及其相似种的分子标记技术(RAPD)鉴别

目的以30个随机引物对三角帆蚌及其相似种进行鉴别分析。方法随机扩增多态DNA(RAPD)分析。结果最终筛选出2个引物,分别能扩增出1～5条大小不等的片段,片段长度在250～1000bp之间。结论RAPD的技术方法能鉴别三角帆蚌软体组织与相似种软体组织。     

5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性中的可行性研究

目的探讨5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性研究中的可行性。方法提取不同产地穿心莲总DNA后,PCR特异扩增5SrRNA基因间隔区,采用荧光标记末端终止子双脱氧末端终止法测序,对测序结果进行多序列联配分析。结果成功得到321bp的5SrRNA基因间隔区碱基序列,经过多序列联配分析发现,不同产地穿心莲的此段5SrRNA基因间隔区DNA序列之间没有差异。结论5SrRNA基因间隔区DNA序列不适合用于研究穿心莲药材的道地性。     

Identification of the crude drug atractylodes rhizome (Byaku-jutsu) and atractylodes lancea rhizome (So-jutsu) using chloroplast TrnK sequence as a molecular marker

Novel methods for molecular authentication of Atractylodes-derived crude drugs (Jutsu) were established based on PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) and direct sequencing of chloroplast trnK. Two regions inside the chloroplast trnK were selected as molecular markers for identification and discrimination of Atractylodes Rhizome (Byaku-jutsu) and Atractylodes Lancea Rhizome (So-jutsu). The Region 1 fragment (260 bp) amplified from So-jutsu and Wa-byaku-jutsu (Atractylodes Rhizome derived from A. japonica) gave 2 bands of 180 bp and 80 bp on agarose gel electrophoresis after digestion with a restriction endonuclease HinfI, whereas the fragment amplified from Kara-byaku-jutsu (Atractylodes Rhizome derived from A. ovata) remained undigested, which allowed unambiguous identification of Kara-byaku-jutsu. By direct sequencing of Region 2 (436 bp) and comparison of the nucleotide sequence data sets we could not only discriminate Byaku-jutsu and So-jutsu but also identify the original plant species of each crude drug specimen. A simple and reliable protocol for rapid preparation of DNA suitable for PCR from as little as 1 mg of Atractylodes-derived crude drugs was also described.     

测序技术在缺失型脊髓性肌萎缩症基因诊断中的应用

【摘要】目的 探索将测序技术应用于缺失型脊髓性肌萎缩症（SMA）基因诊断的可行性。方法设计2对引物,PCR扩增SMA致病基因运动神经元生存基因（SMN1）与其同源基因SMN2之间5个不同碱基所在区域,第1对引物正向扩增SMN1内含子6至7间长度为501bp片段,包含4个不同碱基位点g.31957、32006、32154及32269;第2对引物反向扩增SMN1外显子8区域,长度为189bp,包含1个不同碱基位点g.32734。根据测序图谱区分SMA患者与携带者和（或）正常人。将此方法应用于7个临床疑似SMA家系的诊断,并与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）法进行比较。结果6例测序图谱显示SMN内含子6至外显子8之间5个SMN1和SMN2差异位点 g.31957、32006、32154、32269及32734均只有SMN2特有碱基a、T、g、g和A,患儿父母（携带者）相同位点显示为a/g、 T/C、g/a、g/a和A/G。说明患者缺失SMN1基因,缺失范围包括内含子6至外显子8;携带者则既有SMN1基因,又有 SMN2基因,与患者能区分开。1例检测结果为a、T、g、g和A/G,说明其缺失范围不含外显子8。测序法与PCR-RFLP 方法结果一致。结论测序技术在缺失型SMA患者的基因诊断上优于经典PCR-RFLP法,更方便快捷,结果更明确,建议替代常用的PCR-RFLP法。     

射干及类似药用植物叶绿体rbcL基因序列分析

目的 对射干Belamcanda chinensis (L.) DC.,鸢尾Iris tectorum Maxim.,野鸢尾I.dichotoma Pall.,蝴蝶花I.japonica Thunb.和德国鸢尾I.germaica L.等5种药用植物进行叶绿体rbcL基因序列分析,并对其亲缘关系进行探讨。方法CTAB(Cetyl trimelhyl ammonium bromide,CTAB)法提取总DNA,用作者设计的引物对鸢尾科5种药用植物的叶绿体rbcL(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylose Large Gene,rbcL)基因进行扩增,PCR扩增产物纯化后,用ABI310 DNA自动测序仪测序。结果获得射干和4种鸢尾属药用植物叶绿体rbcL基因部分序列(约750 bp),除德国鸢尾外, 其余4种药用植物的rbcL基因序列为首次获得;用clustal 8.0,MEGA 2.0等软件分析统计获得的目的基因片段,得到碱基突变点,遗传距离［碱基差异数(1.000～20.000)、颠换数为(0.000～9.000)、转换数为(0.000～14.000)］,根据rbcL基因部分序列数据建立分子系统树。结论根据叶绿体rbcL基因序列数据可以很好的鉴别5种鸢尾科植物。     

Identification of Panax species in the herbal medicine preparations using gradient PCR method

In order to identify the existence of Panax species in herbal medicine preparations, the Ginseng specific marker primer was selected and created based on the sequence of Korean ginseng DNA fragment, 359 bp. The gradient PCR was performed on 40 types of the herbal medicines including the 7 types of Araliaceae that are in the same family with the Panax ginseng using the created Ginseng maker primer. As result, Panax notoginseng (Chinese), Panax japonicus (Japanese) and Panax quinquefolius (American), along with Panax ginseng (Korean) were the only ones amplified. However, in the case of Atractylodes lancea, one of the herbal medicines not categorized as Panax species, the DNA was prominently amplified by the Ginseng marker primer. The sequence of the amplified DNA of Atractylodes lancea was identified, resulting in enabling the differentiation from the Panax species by the Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) method. In addition, the results of the gradient PCR performed on the herbal medicine preparations that consists of Panax ginseng showed that 290 bp size of the original DNA fragments of Panax ginseng was amplified on the herbal medicine preparations containing Panax ginseng. Therefore, these results suggest a possibility of creating a new testing method for identifying specific herb medicines using the gradient PCR, a molecular biological method not only on Panax ginseng, but also on other herbal medicines and herbal medicine preparations.     

两步法PCR-CTPP技术在单核苷酸多态性研究中的应用

目的建立两步法聚合酶链反应(PCR)-CTPP技术体系,研究在单核苷酸多态性(SNP)等位基因分型中的应用价值。方法采用两步法PCR-CTPP技术检测180名正常个体p73基因第二外显子G4C14-A4T14多态性,并以PCR-RFLP和DNA测序验证基因分型结果。结果通过两步法PCR-CTPP得到的基因分型结果与PCR-RFLP和DNA测序得到的基因分型结果完全一致。结论两步法PCR-CTPP技术省时,结果稳定可靠,对于SNP等位基因分型具有较高的应用价值。     

基于ITS序列鉴别特色民族药材土牛膝及其混伪品的研究

目的:利用DNA条形码对特色民族药材土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝)及其混伪品进行分子鉴定。方法:利用DNA条形码方法,分别对土牛膝及其混伪品的ITS和MatK基因片段进行扩增并双向测序,使用Codon Code Aligner软件对扩增序列进行拼接,用MEGA软件对数据比对分析,并基于K2P模型进行遗传距离分析,构建邻接(NJ)系统聚类树鉴定分析。结果:3种植物基原土牛膝药材粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝的ITS序列种内最大K2P距离均小于其种间最小K2P距离;所构建的系统NJ聚类树图显示土牛膝药材与其混伪品可明显区分开,表现出良好的单系性;而基于MatK序列构建的系统聚类树图不能将不同基原土牛膝区分。结论:ITS作为DNA条形码可方便快捷地鉴别土牛膝及其混淆品。     

市售鹿鞭的DNA指纹鉴定研究

目的：探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因（Cytb）部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法对市售鹿鞭进行样本处理,模板制备,采用鹿鞭特异性引物进行PCR反应,对市售鹿鞭样本采取DNA指纹鉴定。结果对市售鹿鞭中药材进行mtDNA鉴定,有三个样本为正品。结论此方法对市售鹿鞭鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行,说明鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于市售鹿鞭的鉴定。     

鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cyt b 基因全序列分析的基础上,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu01-L和ILu01-H。结果　在6 4℃的复性温度下,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约365bp阳性扩增带;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定,结果表明:3批鹿茸仅一批为正品,2批鹿鞭皆为伪品,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取2枚鹿茸及一个原动物做Cyt b 基因片段序列分析,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

Sequence analysis of chloroplast chlB gene of medicinal Ephedra species and its application to authentication of Ephedra Herb

Chloroplast chlB gene encoding subunit B of light-independent protochlorophyllide reductase was amplified from herbarium and crude drug specimens of Ephedra sinica, E. intermedia, E. equisetina, and E. przewalskii. Sequence comparison of the chlB gene indicated that all the E. sinica specimens have the same sequence type (Type S) distinctive from other species, while there are two sequence types (Type E1 and Type E2) in E. equisetina. E. intermedia and E. prezewalskii revealed an identical sequence type (Type IP). E. sinica was also identified by digesting the chlB fragment with Bcl I. A novel method for DNA authentication of Ephedra Herb based on the sequences of the chloroplast chlB gene and internal transcribed spacer of nuclear rRNA genes was developed and successfully applied for identification of the crude drugs obtained in the Chinese market.