罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞胞外基质产生及降解的影响

目的:探讨罗格列酮(rosiglitazone maleate)对糖尿病肾病的保护机制。方法:大鼠肾小球系膜细胞分别培养在正常糖浓度(5.5mmol/L),高糖浓度(25mmol/L)及25mmol/L葡萄糖+20μmol/L罗格列酮的培养液中。CCK-8测定系膜细胞增殖;ELISA法检测培养上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1);明胶酶谱法检测培养上清液基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,9)的活性。结果:高糖组系膜细胞较正常对照组出现增殖增加,合成基质蛋白Col-Ⅳ、FN增多;MMP-2及MMP-9活性下降;TIMP-1含量增加;TGF-β1分泌增加。与高糖组比较,罗格列酮干预后能逆转上述变化。结论:罗格列酮能抑制高糖培养的系膜细胞增殖,减少胞外基质合成,增加胞外基质的降解。     

非诺贝特和罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞胞外基质产生和氧化应激的抑制作用

目的探讨非诺贝特(FB)和罗格列酮(RG)对糖尿病肾病的保护机制。方法大鼠肾小球系膜细胞分别培养于正常葡萄糖浓度(5.5mmol·L-1,正常对照)、高糖浓度(HG,25mmol·L-1)、HG+FB100μmo·lL-1和HG+RG20μmol·L-1。比色法检测培养液中的超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量。ELISA法检测培养上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)及纤连蛋白(FN)含量。结果与正常对照组比较,HG组系膜细胞上清中基质蛋白Col-Ⅳ和FN含量增多;总SOD(T-SOD)和Cu,Zn-SOD活性下降;GSH含量下降;MDA含量增加。FB或RG干预后能部分或完全逆转上述变化。与HG组比较,FB或RG干预后,上清液中Col-Ⅳ含量下降〔48h:(21.2±3.2)vs(17.7±2.2),(17.0±3.2)μg·L-1〕,FN含量减少〔48h:(13.5±1.3)vs(12.1±1.0),(11.8±1.1)μg·L-1〕;GSH含量增加〔36h:(94.0±30.3)vs(109.8±35.6),(111.0±28.5)g·L-1〕;T-SOD活性增强〔36h:(10.8±2.2)vs(13.3±2.7),(12.8±3.3)kNU·L-1〕;MDA含量下降〔36h:(18.6±20.5)vs(11.8±7.0),(11.3±7.2)μmol·L-1〕。结论FB和RG均能减少高糖培养的系膜细胞胞外基质合成,并显著缓解高糖诱导的氧化应激。     

普伐他汀对高糖培养肾小球系膜细胞P38促分裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的探讨普伐他汀对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(MC)p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号传导通路的影响。方法大鼠MC分别培养在正常糖5.5mmol·L-1(正常对照组),高糖25mmol·L-1(高糖组),葡萄糖25mmo.lL-1+p38MAPK特异性抑制剂SB203580(SB)10μmol.L-1,及葡萄糖25mmol·L-1+普伐他汀(PV)100μmol·L-1。ELISA法检测培养上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤连蛋白(FN)含量;Phospho-ELISA法检测胞浆及胞核内p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白的表达;以及RT-PCR法检测p38MAPK mRNA的表达。结果与正常对照组比较,高糖组MC合成基质蛋白Col-Ⅳ,FN增多;胞浆及胞核内p-p38MAPK的表达增加。SB或PV干预能部分或完全逆转这一变化。与高糖组比较,SB干预后,上清液中Col-Ⅳ含量下降〔48h:(21.19±3.21)vs(16.75±1.93)μg·L-1,n=6,P<0.05〕、FN减少〔48h:(13.47±1.27)vs(12.01±0.85)μg·L-1,n=6,P<0.05〕;胞浆及胞核内p-p38MAPK表达显著下调。PV干预后,上清液中Col-Ⅳ含量下降〔48h:(21.19±3.21)vs(14.97±3.04)μg·L-1,n=6,P<0.05〕、FN减少〔48h:(13.57±1.27)vs(11.99±0.98)μg·L-1,n=6,P<0.05〕;胞核内p-p38MAPK表达显著下调,但对胞浆内p-p38MAPK的表达则无显著影响。各组总p38MAPK蛋白水平及p38MAPK mRNA表达则没有明显改变。结论PV能够显著下调高糖培养的MC胞核内p38MAPK信号传导通路的活化,进而减少胞外基质合成,达到对糖尿病肾病的治疗作用。     

积雪草酸对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞氧化应激及细胞外基质分泌的影响

目的 探讨积雪草酸对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞氧化应激及细胞外基质分泌的影响.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分为高糖组(A组)、高糖加积雪草酸干预组(B组)、正常对照组(C组).培养1周、2周、3周后,分光光度计比色法检测细胞培养液上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量,ELISA法检测培养液上清液中转化生长因子β1(TGF-β1)、纤连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的含量.结果 与C组相比,A组细胞上清液SOD活力下降,MDA含量增加,且随时间延长变化越明显(P＜0.05);细胞上清液中TGF-β1、FN、Col-Ⅳ分泌量均增加,并且FN分泌量随时间延长变化越明显(P＜0.05).与A组相比,B组细胞上清液SOD活力增加,MDA含量下降,TGF-β1、FN、Col-Ⅳ分泌量减少(P＜0.05).结论 积雪草酸可以缓解高糖诱导的系膜细胞氧化应激损伤以及减少细胞外基质的分泌,对糖尿病肾病大鼠起肾保护作用.     

大黄酸对人肾小球系膜细胞功能的影响

目的探讨大黄酸防治糖尿病肾病的作用机制。方法用细胞培养、ELISA、明胶酶谱及免疫沉淀、Western blot等技术,研究了大黄酸对肾小球系膜细胞转化生长因子(TGFβ₁)、基质金属蛋白酶-2,-9(MMP-2和MMP-9)及p38活化丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性的作用。结果大黄酸可显著抑制肾小球系膜细胞的增殖,对抗高糖诱导肾小球系膜细胞TGFβ₁活性升高的作用;对高糖诱导肾小球系膜细胞MMP-2,MMP-9,pro-MMP-2及pro-MMP-9的活性增加无明显影响,但可明显对抗高糖引起的肾小球系膜细胞p38MAPK活性增加。结论大黄酸减少FN的分泌可能与其降低p38MAPK及TGFβ₁活性有关。     

缬沙坦对高糖培养的肾小球系膜细胞p38MAPK传导通路的影响

目的探讨高糖状态下肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、其上游因子MAPK激酶3/6(MKK3/6)和下游因子cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)的表达以及血管紧张素受体1拮抗剂(AT1Ra)缬沙坦的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予高糖和缬沙坦干预,采用Western bolt检测MKK3/6、p38 MAPK和CREB1及其磷酸化蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测系膜细胞内TGF-β1和FN mRNA的表达。放免法测定细胞上清液中纤维连接蛋白(FN)和IV型胶原的含量。MTT法检测缬沙坦在不同时间、不同药物浓度对细胞增殖状态的影响。结果①与低糖对照组相比,高糖组系膜细胞p-p38 MAPK、p-MKK3/6和p-CREB1表达明显上调,TGF-β1和FN mRNA的表达增加,FN和IV型胶原含量增加。②缬沙坦组p-p38 MAPK、p-MKK3/6和p-CREB1的表达明显下调,TGF-β1和FN mRNA的表达降低,同时FN和IV型胶原的含量减少。③MTT法检测显示不同浓度的缬沙坦对细胞增殖状态都有所抑制,并随药物浓度的增加而作用增强。结论缬沙坦抑制肾小球系膜细胞TGF-β1的表达和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK传导通路的激活来实现的。     

糖尿病大鼠肾间质TGF-β1表达与细胞外基质沉积的关系

目的：了解糖尿病（DM）大鼠肾间质转化生长因子－β1（TGF－β1）表达与纤维粘连蛋白（FN）和胶原Ⅲ型（ColⅢ)沉积的关系。方法：四氧嘧啶复制糖尿病模型，免疫组化法检测肾间质TGF－β1、FN和ColⅢ,PAS染色观察肾组织形态学改变。结果：正常肾间质和糖尿病1周，可见FN和ColⅢ,但未见TGF－β1表达，糖尿病2周开始肾小管见TGF－β1表达，并随疾病进展而逐渐增多。糖尿病1月肾间质中见FN和ColⅢ沉积开始增多，2月时更多，FN和ColⅢ增多与TGF－β1呈正相关。结论：TGF－β1促进糖尿病大鼠肾小管间质FN和ColⅢ的沉积。     

祛瘀化痰、散结消癥中药复方对细胞外基质降解调控系统及TGF-β_1 mRNA的影响

目的:研究祛瘀化痰、散结消癥中药复方对肾小球硬化中细胞外基质(ECM)降解调控系统及转化生长因子(TGF)-β1 mRNA的影响。方法:采用脂多糖刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞,复制细胞增殖模型,用给药动物血清干预后,酶联免疫吸附法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制物(TIMP-1)的表达,计算MMP-9与TIMP-1比值,荧光定量PCR法检测细胞TGF-β1 mRNA表达。结果:各祛瘀化痰、散结消癥中药复方均能不同程度地抑制TIMP-1、上调MMP-9的表达,提高MMP-9与TIMP-1的比值,并下调细胞中TGF-β1 mRNA表达,其中以川芎+鳖甲+海藻组作用最明显。结论:祛瘀化痰、散结消癥中药复方能增强ECM降解,下调肾小球系膜细胞中TGF-β1 mRNA表达。     

阿托伐他汀对高糖培养人肾系膜细胞的作用

目的探讨阿托伐他汀对糖尿病肾病的保护作用及其机制。方法对高糖培养人肾系膜细胞进行阿托伐他汀干预试验,观察人肾系膜细胞增殖、肾上腺髓质素(AM)、转化生长因子β1(TGF β1)mRNA表达的影响,及细胞培养液中AM、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、TGF β1、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原含量的变化。结果阿托伐他汀对高糖培养下人肾系膜细胞的过度增殖,TGF β1、AngⅡ、AM、LN和Ⅳ型胶原合成、分泌增多的变化具有明显的抑制作用(P<0 01)。结论阿托伐他汀可抑制高糖刺激的肾系膜细胞增殖,通过抑制AngⅡ、TGF β1 的表达、分泌,降低基质蛋白生成和沉积,发挥其肾脏保护作用。在AngⅡ、TGF β1 的表达和分泌下降后,AM的表达和分泌也随之下降。     

白花丹素抑制肾小球系膜细胞增殖及促纤维化相关因子的表达

目 的：探讨白花丹素对人肾小球系膜细胞株HMC细胞增殖及TGFβ1、CTGF、FN表达的影响。 方 法： 1 μmol/L~10 μmol/L白花丹素分别处理HMC细胞后,MTT法检测细胞增殖活性;RT-PCR和细胞免疫荧光法分别检测TGFβ1、CTGF、FN mRNA和蛋白的表达。 结 果：1 μmol/L~10 μmol/L白花丹素作用后,HMC细胞呈时间、浓度依赖性生长抑制,TGFβ1、CTGF、FN mRNA和蛋白的表达下降。 结 论： 白花丹素通过降低HMC细胞TGFβ1、CTGF、FN的表达,抑制HMC细胞增殖。     

非诺贝特及罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞核因子κB信号通路调控的影响

目的探讨过氧化物酶增殖体激活受体(PPAR)激动剂对糖尿病肾病(DN)作用的机制。方法将大鼠肾小球系膜细胞(MC)分4组:正常对照组(葡萄糖5.5mmol·L-1)、高糖组(HG,葡萄糖25mmol·L-1)、非诺贝特(FB)100μmol·L-1组和罗格列酮(RG)20μmol·L-1组。ELISA法检测培养细胞上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)和纤连蛋白(FN)含量;RT-PCR法检测核因子κB(NF-κB)mRNA的表达;ELISA法检测胞浆及胞核内总NF-κBp65、活性NF-κBp65和磷酸化NF-κBp65表达。结果与正常对照组比较,HG组MC合成基质蛋白Col-Ⅳ和FN增多;HG组MC胞核内核定位序列(NLS)-NF-κBp65和Ser276-NF-κB的表达显著增加;FB或RG干预后能部分或完全逆转上述变化。与HG组比较,FB或RG组上清液中Col-Ⅳ含量下降48h:(21.2±3.2)vs(17.7±2.2),(17.0±3.2)μg.L-1、FN减少48h:(13.5±1.3)vs(12.1±1.0),(11.8±1.1)μg.L-1。各组MC胞浆内NLS-NF-κBp65和Ser276-NF-κB表达则无显著变化;各组NF-κBmRNA表达及总NF-κBp65蛋白水平亦无明显改变。结论PPAR激动剂通过下调MC胞核内NF-κB信号传导通路的活化,进而减少胞外基质合成,达到对DN的治疗作用。     

氯沙坦抑制糖基化终末产物刺激培养的人内皮细胞外基质基因的表达

目的 探讨氯沙坦防治糖尿病血管病变的作用机理。方法 用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Northern印迹杂交方法测定了0.1～10 μmol·L^-1浓度的氯沙坦对经体外制备的糖基化终末代谢产物（AGEs）处理培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）转化生长因子（TGF）-β₁和纤连蛋白（FN）基因表达的影响。结果 由AGEs处理的HUVECs TGF-β₁和FN mRNA表达较正常对照组明显增高；与AGEs组相比，TGF-β₁和FN mRNA的表达在氯沙坦1.0 μmol·L^-1时分别降低了29%和23%，10 μmol·L^-1时降低了56%和62%。结论 氯沙坦通过抑制AGEs刺激的内皮细胞TGF-β₁和FN mRNA表达，从而抑制细胞外基质的生成，防止血管重构可能是其防治糖尿病血管并发病的机理之一。     

前列腺素F_(2α)增强膜去极化和升高胞内钙促进NIT-1β细胞胰岛素分泌

目的探讨前列腺素F2α(PGF2α)促进NIT-1β细胞葡萄糖刺激性胰岛素分泌的作用机制。方法放射免疫法检测NIT-1β细胞胰岛素分泌量;激光共聚焦显微镜检测细胞[Ca2+]i。结果葡萄糖浓度为16.5mmol·L-1时,PGF2α5μmo·lL-1或钾通道阻断剂四乙胺(TEA)20mmol·L-1均使NIT-1β细胞胰岛素分泌明显增加,而先给予TEA后再加PGF2α或先给PGF2α再加TEA均不能使胰岛素分泌进一步增加。葡萄糖浓度为5.5mmol·L-1时,PGF2α不能使胰岛素分泌增加,预先给予20mmol·L-1TEA再应用PGF2α,胰岛素分泌显著增加。60mmol·L-1KCl和250μmol·L-1二氮嗪使细胞膜处于最大去极化状态时,PGF2α不能促进胰岛素分泌。16.5mmol·L-1葡萄糖浓度下,预先给予氯通道阻断剂4,4′-二异硫氰酸水合茋-2,2′-二磺酸(DIDS),PGF2α不能促进胰岛素分泌。另外,16.5mmol·L-1葡萄糖下,5μmol·L-1PGF2α引起NIT-1β细胞[Ca2+]i升高,而预先给予60mmol·L-1KCl和250μmo·lL-1二氮嗪后再给予PGF2α不能引起细胞[Ca2+]i升高;在DIDS作用下,NIT-1β细胞[Ca2+]i显著降低,恢复静息期后给予PGF2α,细胞[Ca2+]i再次降低。结论促进细胞膜去极化在PGF2α增强胰岛素分泌中起着重要作用。PGF2α可能通过激活氯通道,增强NIT-1β细胞膜去极化,升高细胞[Ca2+]i,促进高浓度葡萄糖刺激下的胰岛素分泌。     

曲格列酮对转化生长因子-β_1诱导的HK-2细胞纤连蛋白和胶原Ⅰ型基因表达的影响

目的观察曲格列酮对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)细胞外基质纤连蛋白和胶原Ⅰ型的影响,探讨曲格列酮抗肾间质纤维化的潜在作用。方法将曲格列酮0,0.25,0.5,1,2.5,5和10μmol.L-1预处理HK-2细胞2h,随后加入TGF-β15mg.L-1作用24h,利用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测曲格列酮对HK-2细胞的毒性作用;曲格列酮0,1,2.5,5和10μmol.L-1预处理HK-2细胞2h,再加入TGF-β15mg.L-1作用24h,通过实时荧光定量PCR检测HK-2细胞外基质主要成分胶原Ⅰ型mRNA和纤连蛋白mRNA表达。结果曲格列酮0.25～5μmol.L-1对HK-2细胞膜完整性无影响,LDH的释放与正常对照组无明显差异,曲格列酮10μmol.L-1组LDH释放率为(10.7±5.3)%,明显高于正常对照组(P<0.01)。与正常对照组相比,曲格列酮1,2.5,5和10μmol.L-1单独作用并没有增加HK-2细胞外基质中胶原Ⅰ型纤维和纤连蛋白的表达,而TGF-β1刺激下胶原Ⅰ型纤维和纤连蛋白表达明显上调,曲格列酮提前干预下纤连蛋白mRNA及胶原Ⅰ型mRNA表达下降,曲格列酮2.5,5和10μmo.lL-1可显著下调纤连蛋白mRNA表达(P<0.05,P<0.01);曲格列酮5和10μmol.L-1可显著下调胶原Ⅰ型mRNA表达(P<0.05)。结论曲格列酮可能具有拮抗肾间质纤维化的潜在作用,其作用机制可能与抑制HK-2细胞纤连蛋白和胶原Ⅰ型纤维的增加有关。     

贝那普利对糖尿病大鼠心肌细胞外基质重塑中基质金属蛋白酶及转化生长因子表达的影响

目的研究贝那普利对糖尿病大鼠心肌基质重塑的作用机制。方法 SD大鼠ip注射链脲佐菌素制备糖尿病模型。治疗组ig给予BZ 10 mg.kg-1,连续12周。光镜及电镜下观察左心室心肌组织改变,测定心脏质量指数;Western印迹法测定左心室心肌组织胶原Ⅰ型及Ⅲ型含量,基质金属蛋白酶2(MMP-2),金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)表达及转化生子因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)表达的变化。结果与正常对照组相比,糖尿病组大鼠心脏质量指数明显升高,胶原Ⅰ型及Ⅲ型表达明显增加(P<0.05),MMP-2表达减少、TIMP-2表达增加(P<0.01),TGF-β1和CTGF表达明显增强(P<0.05),心肌间质纤维增生。大鼠连续ig给予贝那普利12周后,心脏质量指数明显降低〔(4.13±0.18)vs(3.42±0.13)mg.g-1〕;胶原Ⅰ型及Ⅲ型表达明显减少(P<0.05),MMP-2表达增加,TIMP-2表达减少(P<0.05),TGF-β1及CTGF表达明显减弱(P<0.05),心肌间质纤维增生减轻。与正常对照组相比,贝那普利组大鼠心肌MMP-2表达减少,TIMP-2及CTGF表达仍增加。结论贝那普利可能通过抑制糖尿病大鼠心肌组织TGF-β1和CTGF表达以及增强基质金属蛋白酶表达,从而抑制糖尿病心肌间质纤维化,改善心肌细胞外基质重塑。     

邻苯二甲酸二乙基己基酯对新生大鼠肺组织发育的影响

目的探讨基质金属蛋白酶9(MMP-9)、金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)和转化生长因子β1(TGF-β1)是否参与邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)影响肺组织形态发育的过程。方法 SD新生大鼠于出生后第1天开始分别ip给予DEHP 10,100和750 mg.kg-1,每天1次。每组1/2大鼠持续染毒14 d,剩余1/2大鼠持续染毒21 d。染毒结束后第2天处死大鼠,取新鲜肺组织,提取总RNA,用实时定量PCR方法检测MMP-9,TIMP-1和TGF-β1mRNA的表达;其余部分石蜡包埋,制备石蜡切片,HE染色进行组织形态观察,或者免疫组化染色检测MMP-9,TIMP-1和TGF-β1蛋白表达。结果 DEHP染毒14 d,与溶剂对照组比较,DEHP 100和750 mg.kg-1组新生大鼠肺泡发育受抑制,肺间质比例增大(P<0.05);DEHP10,100和750 mg.kg-1组MMP-9和TGF-β1mRNA表达随着DEHP染毒剂量的增加而增加(r=0.979,P<0.01;r=0.990,P<0.01),MMP-9和TGF-β1蛋白表达亦随着DEHP染毒剂量的增加而增加(r=0.770,P<0.01;r=0.959,P<0.01);TIMP-1 mRNA和蛋白表达下降(r=0.904,P<0.01;r=0.795,P<0.01)。DEHP染毒21 d,DEHP 10,100和750 mg.kg-1组肺间质比例与溶剂对照组比较无明显变化;MMP-9和TGF-β1mRNA表达随着DEHP染毒剂量的增加而下降(r=0.879,P<0.01;r=0.904,P<0.01),MMP-9和TGF-β1蛋白表达亦随着DEHP染毒剂量的增加而下降(r=0.935,P<0.01;r=0.819,P<0.01);TIMP-1 mRNA和蛋白表达增加(r=0.819,P<0.01;r=0.619,P<0.01)。结论 DEHP通过影响肺组织MMP-9,TIMP-1和TGF-β1基因和蛋白的表达影响新生大鼠肺组织形态发育。     

胍丁胺对异丙肾上腺素诱发人心房纤维迟后除极的影响

用标准微电极技术研究胍丁胺对异丙肾上腺素 (Iso) 诱发人心房纤维迟后除极的影响. 结果如下：(1) 胍丁胺 (1-10 mmol·L^-1)以浓度依赖地方式明显抑制Iso (20 nmol·L^-1) 诱发人心房纤维的迟后除极;(2) 预先应用咪唑啉受体和α₂肾上腺素受体拮抗剂咪唑克生(0.1 mmol·L^-1) 可阻断胍丁胺 (10 mmol·L^-1) 对Iso(20 nmol·L^-1)诱发迟后除极的抑制作用;(3) 预先应用一氧化氮合酶抑制剂硝基-L-精氨酸甲酯(0.5 mmol·L^-1),不影响胍丁胺 (10 mmol·L^-1) 对Iso(20 nmol·L^-1)诱发迟后除极的抑制作用. 结果表明,胍丁胺对Iso诱发人心房纤维迟后除极的抑制作用可能是由于咪唑啉受体和α₂肾上腺素受体介导钙内流减少所致.