麦芽酚铝对PC12细胞钙稳态和凋亡的影响

目的探讨麦芽酚铝[aluminum maltolate,Al(mal)_3]染毒对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(rat pheochromocytoma cells,PC12)钙稳态及凋亡的影响。方法将PC12细胞随机分为0(对照组)、50、100、200、400μmol/L Al(mal)_3染毒组,分别培养12、24、48 h,采用CCK-8试剂盒检测PC12细胞活性,以流式细胞术检测PC12细胞内游离钙离子荧光强度[Ca(~2+)]i及细胞凋亡率。结果随着Al(mal)_3染毒时间和染毒剂量的增加,PC12细胞活性逐渐下降,细胞[Ca(~2+)]i与细胞总凋亡率逐渐升高。除50μmol/L Al(mal)_3染毒12、24 h及100μmol/L Al(mal)_3染毒12 h外,其他各剂量组染毒PC12细胞12、24、48 h后细胞活性均低于对照组,细胞[Ca(~2+)]i均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。400μmol/L Al(mal)_3染毒PC12细胞12 h,200、400μmol/L Al(mal)_3染毒24 h,100、200、400μmol/L Al(mal)_3染毒48 h后,PC12细胞总凋亡率均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论钙超载可能是Al(mal)_3引起凋亡发生的主要机制。     

麦芽酚铝对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞β-淀粉样蛋白42蛋白表达的影响及其作用机制

目的探讨铝对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞β-淀粉样蛋白(Aβ)42表达的影响及其作用机制。方法将处于对数生长期的PC12细胞分别暴露于含麦芽酚铝终浓度为0(对照)、50、100、200和400μmol/L的完全培养基染毒12、24、48 h。采用CCK-8法测定细胞活性,采用酶联免疫吸附(ELISA)测定法测定PS1、Aβ42蛋白的含量。结果与对照组比较,200、400μmol/L麦芽酚铝染毒12 h时及各浓度麦芽酚铝染毒24 h、48 h时PC12细胞的存活率均较低,差异有统计学意义(P0.05);且随着麦芽酚铝染毒浓度的升高,不同染毒时间PC12细胞的存活率均呈逐渐降低的趋势。与对照组比较,400μmol/L麦芽酚铝染毒12 h时及200、400μmol/L麦芽酚铝染毒24 h、48 h时PC12细胞PS1蛋白的含量均增加,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,400μmol/L麦芽酚铝染毒12 h时及200、400μmol/L麦芽酚铝染毒24 h时以及100、200、400μmol/L麦芽酚铝染毒48 h时PC12细胞Aβ42蛋白的含量均增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论γ-分泌酶表达增加可能是铝致PC12细胞Aβ42蛋白含量增多的重要原因之一。     

miR - 107在铝引起学习记忆下降及Aβ1 - 42沉积中的作用

目的 探讨miR - 107在麦芽酚铝染毒致大鼠学习记忆下降及Aβ1 - 42表达升高中的作用机制。方法 细胞实验:麦芽酚铝染毒HEK293细胞,对照组、低剂量组（100 μmol/L）、中剂量组（200 μmol/L）、高剂量组（400 μmol/L）染毒24 h, RT - qPCR检测 miR - 107表达水平,ELISA检测 BACE1、Aβ1 - 42表达量。动物实验:健康2月龄雄性SD大鼠,按体重随机分为对照组（生理盐水）、低剂量组（10 mM/kg）、中剂量组（20 mM/kg）、高剂量组（40 mM/kg）,采用腹腔注射染毒45 d,Morris水迷宫实验测定大鼠的学习记忆能力, RT - qPCR检测大鼠海马miR - 107的相对表达量。结果 不同剂量麦芽酚铝染毒HEK293细胞24 h后,与对照组相比,低、中、高剂量组miR - 107相对表达量降低（F = 11.385,P＜0.001）;中、高剂量组BACE1和Aβ1 - 42表达量均升高（P＜0.05）。Morris水迷宫实验结果:定位航行实验表明大鼠逃避潜伏期没有变化（F = 0.662, P＞0.05）;空间探索实验表明大鼠穿越平台次数（F = 0.069,P＞0.05）和目标象限停留时间(F = 0.779,P＞0.05)均没有变化。RT - qPCR结果:与对照组相比,中、高剂量组大鼠海马miR - 107相对表达量降低（F = 16.654,P＜0.01）。结论 麦芽酚铝染毒后,miR - 107相对表达量在染铝早期即出现降低:BACE1、Aβ1 - 42表达量升高,提示铝染毒致大鼠学习记忆能力下降及BACE1、Aβ1 - 42表达升高可能与早期miR - 107表达降低有关。     

一氧化氮合酶抑制剂干预前后软骨藻酸对PC12细胞存活率及NO的影响

[目的]研究一氧化氮合酶（NOS）抑制剂干预前后软骨藻酸（DA）对PC12细胞存活率及其产生一氧化氮（NO）的影响。[方法]MTT法检测PC12细胞的存活率;Greiss法测定PC12细胞培养基上清中的NO含量。L-NAME干预前,MTT实验分为对照组及0．0001、0．001、0．01、0．1、1．0μmol／LDA处理组;NO含量测定时分为对照组及0．01、0．1、1．0μmol／LDA处理组。L-NAME干预时,MTT实验及NO含量测定均分为对照组,单纯1．0μmol／LDA处理组,250、1000、2500μmol／L L-NAME＋1μmol／LDA处理组。[结果]随着DA染毒剂量的升高,PC12细胞的存活率逐渐下降;0．01、0．1、1．0μmol／LDA作用PC12细胞24h后,细胞培养基上清NO水平均升高,差异有统计学意义,P〈0．05;L-NAME浓度为1000、2500μmol／L干预时,PC12细胞存活率增加,NO生成减少。[结论]DA对PC12细胞具有毒性作用,可以降低细胞的存活率,诱导细胞NO生成增加;NOS抑制剂具有一定保护作用,可明显抑制DA诱导PC12细胞NO生成增加。     

苯并[α]芘对神经细胞DNA损伤及细胞周期的影响

[目的]通过研究苯并[α]芘（BaP）染毒后神经细胞DNA损伤和神经元细胞周期改变,探索BaP致神经细胞凋亡的机制。[方法]采用新生1-3d的sD大鼠神经元细胞,培养5d。以BaP同时加入S9对细胞染毒,染毒组浓度分别为10、20、40μmol/L,并设空白对照组和溶剂对照组,继续培养48h。以20μmol／L BaP染毒,分别于染毒0、6、12、24、48h后处理细胞。用单细胞琼脂糖凝胶电泳（SCGE）检测DNA损伤,采用流武细胞仪检测细胞周期变化情况。[结果]SCGE结果显示,与空白对照组和溶剂对照组相比,20、40μmol／L染毒组神经细胞Olive尾矩、尾DNA含量、尾长均明显增加,头DNA含量明显降低,且有统计学意义（P〈0．05）。与Oh组相比,染毒48h组神经细胞Olive尾矩、尾DNA含量、尾长均有明显增加,头DNA含量明显降低,差异均有统计学意义（P〈0．05）。流式细胞仪检测结果显示,与空白对照组相比,40μmol／L染毒组G1期和s期神经细胞百分数差异有统计学意义（P〈0;05）;与Oh组相比,染毒48h组G1期和S期神经细胞百分数明显增加,且差异有统计学意义（P〈0．05）。[结论]BaP可引起神经细胞DNA断裂,诱发细胞周期重启。     

Nec-1对铝作用下神经细胞活力及凋亡、自吞噬基因的影响

[目的]研究坏死性抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）对铝（Al）作用下的神经细胞活力及凋亡、自吞噬基因的影响。[方法]体外原代培养小鼠神经细胞,通过2mmol／LAl3＋作用于神经细胞制造铝损伤模型,加入不同剂量的Nec-1,用细胞活力检测（CCK-8）和逆转录．聚合酶链反应（RT．PCR）的方法观察Nec-1对染铝神经细胞的作用。[结果]细胞活力检测：以2mmol／LAl3＋染毒组作为对照,30μmol／LNec-1组的细胞活力与对照组比较,差别有统计学意义（P〈0．05）,60、90μmol／LNec-1组与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）.RT-PCR结果：2mmol／LAl3＋染毒组caspase-3基因的表达为0．98±0．120,而Nec-160μmol／L组和Nec-190μmol／L组caspase-3的表达分别为0．50±0．077和0．44±0．050,同对照组相比,两组caspase-3的表达均下降（P〈0．01）。2mmol/LAl3＋染毒组的LC3-Ⅱ基因的表达为1,82±0．047,而60μmol／LNec-1组和90μmol／LNec-1组的LC3．口表达分别为1．00±0．022和0．97±0．035,同对照组相比,两组LC3-Ⅱ的表达均呈下降（P〈0．01）。[结论]Nec-1可使铝作用下的神经细胞活力上升,并使神经细胞的自吞噬和凋亡基因表达下降。     

无机砷对Chang肝细胞株血红素单加氧酶-1 mRNA和蛋白表达的诱导作用

[目的]观察亚砷酸钠（sodium arsenite,NaAsO2）对Chang肝细胞株血红素单加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）mRNA和蛋白表达的诱导作用。[方法]以5μmol／L和10μmol／L的NaAsO2作用Chang肝细胞株2、6、12h和24h,分别用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot法检测细胞内HO-1的mRNA和蛋白表达情况。[结果]5μmol／L和10μmol／LNaAs02暴露2h开始出现HO-1mRNA的诱导表达;6h的表达水平明显高于对照组和2h暴露组（P〈0．01）。其中,10μmol／LNaAsO2暴露12h和24h的mRNA表达均明显高于该浓度的6h暴露组（P〈0．01）;但24h的HO-1 mRNA表达水平与12h组相比没有明显升高。NaAsO2暴露诱导的HO-1蛋白表达则从6h开始出现,12h组明显高于6h组,24h组明显高于12h组（均P〈0．01）;5μmol／L和10μmol／L NaAsO2分别暴露6、12h和24h的HO-1蛋白表达量分别是对照组的2．80、9．34、18．15和3．97、12．92、23．29倍;此外,10μmol/LNaAsO2暴露12h和24h的HO-1 mRNA和蛋白表达均明显高于对应时间的5μmol／L组（P〈0．01）。[结论]NaAsO2暴露能够有效和持续性诱导Chang肝细胞株HO-1的mRNA和蛋白表达,是无机砷暴露的一种细胞保护性适应性反应。     

镉诱导人胚肾细胞金属硫蛋白基因亚型的表达

[目的]研究镉对人胚肾细胞（HEK293T）金属硫蛋白（MT）各基因亚型表达的影响。[方法]以10μmol/LCdCl2染毒HEK 293T0、2、4、8、12、16、20、24h,2.5、5、10、20、40μmol/LCdCl2染毒HEK293T24h后,采用MTT法测定HEK 293T增殖活性;采用RT-PCR检测镉对HEK 293T MT-1A、MT-1B、MT-1E、MT-1F、MT-1G、MT-1H、MT-1X及MT-2A mRNA表达的影响。[结果]CdCl2染毒HEK 293T 24h后,经10μmol/LCdCl2诱导后,随时间MT-1A、MT-1F、MT-1G、MT-1H及MT-2A mRNA表达水平均呈先升高后降低趋势。MT-1X mRNA水平在8h明显升高（P〈0.05）,16h达到峰值并持续到24h。5μmol/L以上CdCl2均可明显抑制HEK293T活力,与对照组相比差异均有统计学意义（P〈0.05）。MT-1A、MT-1F、MT-1G、MT-1H及MT-2A mRNA在2.5μmol/LCdCl2诱导表达水平均达到峰值,随着剂量增加,MT-1F、MT-1G、MT-1H维持在较高水平,40μmol/L剂量水平仍明显高于对照组（P〈0.05）,MT-1A、MT-2A在40μmol/L降低到基础表达水平。MT-1X mRNA表达水平与染毒剂量呈线性正相关（r=0.75,P〈0.01）。MT-1X的表达与镉对HEK 293T毒性呈负相关关系（r=-0.88,P〈0.01）。[结论]镉可以诱导MT-1F、MT-1G、MT-1H、MT-1X及MT-2A mRNA表达水平明显升高,并表现出特定的剂量-效应和时间-效应关系。     

镉致大鼠前体精原干细胞-支持细胞共培养系损伤的形态变化

[目的]通过对大鼠前体精原干细胞．支持细胞共培养系进行镉染毒,探讨镉对前体精原干细胞和支持细胞共培养系早期效应的形态学变化。[方法]从3天龄的SD大鼠睾丸中分离前体精原干细胞和支持细胞并进行24h共培养后,再分别给予0、2．5、5．0、10．0、20．0μmol／L的氯化镉（CdCl2）染毒12h,然后用碱性磷酸酶和油红O染色分别鉴定前体精原干细胞和支持细胞,观察不同细胞的形态,并用原位末端标识法（TUNEL方法）进行细胞凋亡的原位检测。[结果]2．5μmol／LCdCl2染毒未显著改变共培养中精原干细胞和支持细胞的形态。5．0μmol／L以上浓度CdCl2染毒可致支持细胞（由油红O染色确认）的结构呈现明显变化,具有浓度依赖趋势,用TUNEL法检测发现前体精原干细胞和支持细胞均发生凋亡,和对照组相比差别有统计学意义。[结论]CdCl2染毒12h可诱导支持细胞的形态改变,以及前体精原干细胞和支持细胞的凋亡。     

苯并（a）芘致人支气管上皮细胞DNA损伤及与组蛋白H2A单泛素化水平的关系

[目的]通过体外细胞培养途径,探讨苯并（a）芘（benzo[a]pyrene,B[a]P）作用下人支气管上皮细胞（16HBE）DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化表达水平的关系。[方法]取对数生长期16HBE细胞,采用2μmol/L B[a]P染毒不同时间（0、1、2、4、8、12、24、48h）进行实验,用碱性单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤水平,并以Olive尾矩值（olivetail moments,OTM）评价DNA损伤程度;用Western-blot法检测组蛋白H2A单泛素化水平。[结果]单细胞凝胶电泳结果显示：2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,随着染毒时间的延长,各染毒组细胞DNA损伤程度均明显增高,与对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0.01）;Western-blot结果显示：2μmol/L B[a]P染毒不同时间时,与对照组相比,组蛋白H2A的单泛素化水平增高,且在染毒2h后,差异有统计学意义（P〈0.01）;回归分析显示,单泛素化H2A的表达水平与DNA损伤程度存在高度相关,决定系数（R2）为0.910,P〈0.01。[结论]B[a]P染毒致16HBE细胞DNA损伤与组蛋白H2A单泛素化水平之间存在密切关系。     

组蛋白去乙酰化酶2基因在苯并（a）芘致神经细胞凋亡中的量效和时效表达

[目的]通过体外培养细胞途径研究组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）基因在苯并（a）芘[B（a）P]所致神经细胞凋亡中的量效和时效表达。[方法]大鼠原代培养的神经元细胞分为两批：第一批分4个组,以B（a）P同时加入s9对细胞染毒,分别为二甲基亚砜（DMSO）组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,使其终浓度为0、10、20、40gmol／L,继续培养48h;第二批分5个组,以20gmol／LB（a）P染毒,分别于染毒0、6、12、24、48h处理细胞。用流式细胞术检测神经细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR法检测caspase-3,HDAC2基因的量效和时效表达情况。[结果]①流式细胞术结果显示,与DMSO组相比,中、高剂量组神经细胞的凋亡率明显增加（P〈O．05）;与低剂量组相比,高剂量组凋亡率增加（P〈0．05）。与0h组相比,染毒24、48h组神经细胞的凋亡率明显增加（P〈0．05）。②与DMSO组相比,高剂量组caspase-3、HDAC2mRNA的表达量明显增加（P〈0．01）;与低剂量组相比,高剂量组caspase-3mRNA表达量明显增加（P〈0．05）。与0h组相比,染毒48h组caspase-3、HDAC2mRNA表达量明显升高（P〈0．01,P〈0．05）。[结论]B（a）P可引起神经细胞凋亡,HDAC2基因表达上升,该基因可能在B（a）P所导致的神经细胞凋亡中起重要作用。     

肝细胞生长因子对铅致人肾小球系膜细胞损伤的保护效应的机制

目的初步探讨肝细胞生长因子（HGF）防护铅处理致人肾小球系膜细胞（HMC）损伤的作用机制。方法将HMC分为对照组（C组）、Pb10μmol／L组和HGF＋Pb10μmol／L组,在6、12、24、48h分别通过噻唑蓝（MTY）法检测细胞存活率和用流式细胞仪检测凋亡率;实时荧光定量一PCR检测各组细胞中Caspase-3的表达水平。结果MTr检测结果显示。Pb10pμmol／L组HMC在6、12、24、48h细胞生长存活率均显著低于HGF＋Pb10μmol／L组（P〈0．01）;流式凋亡检测结果显示,HMC在10μmol／L醋酸铅染毒6、12、24和48h后,HGF＋Pb10μmol／L组在各个时间点细胞凋亡率显著低于Pb10μmol／L组（P〈0．01）。实时荧光定量-PCR检测结果显示,在HMC铅染毒48h后,HGF＋Pb10μmol／L组Caspase-3的表达量显著低于Pb10μmol／L组（P〈0．01）。结论铅促进HMC细胞的凋亡,而HGF通过降低Caspase．3的表达抑制HMC的凋亡,从而发挥对铅致HMC细胞损伤的保护作用。     

caspase-3基因在染铝小鼠神经细胞凋亡中的作用

[目的]通过观察染铝小鼠海马的线粒体膜电位、组织形态以及脑组织内活化的caspase-3蛋白含量表达的变化,研究caspase-3 siRNA在铝致神经细胞凋亡中的作用。[方法]取3月龄雄性昆明小鼠,按体重随机分为4组,即空白对照组（生理盐水4μL）、染铝组（0.5%AlCl3.6H2O 4μL）、Al＋RNAi组（0.5%AlCl3.6H2O 3μL＋目的siRNA表达载体1μL）、空载体组（0.5%AlCl3.6H2O 3μL＋对照siRNA表达载体1μL）,通过侧脑室注射进行染毒,连续染毒5 d,各组小鼠海马的凋亡率用流式细胞术检测;线粒体膜电位用罗丹明123（Rhl23）染色流式方法检测;观察小鼠组织学变化;脑组织中活化的caspase-3蛋白的含量用蛋白印迹（Western blot）技术检测。[结果]凋亡率结果显示：与空白对照组相比,染铝组、空载体组的细胞凋亡率升高有统计学意义（P〈0.05）,Al＋RNAi组凋亡率尚无差别（P〉0.05）;线粒体经Rhl23染色呈现明亮绿色的荧光,染铝组和空载体组荧光强度较对照组明显减弱（P〈0.05）,Al＋RNAi组与空白对照组差异无统计学意义;常规HE染色镜下可见空白对照组小鼠海马神经元排列整齐,染铝组细胞排列零乱,细胞连接松解,空载体组细胞数量减少,siRNA处理后细胞状态与空白对照组相似;活化的caspase-3蛋白表达量结果显示染铝组高于空白对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）;空白对照组、空载体组、Al＋RNAi组之间尚无差别（P〉0.05）。[结论]RNA能通过下调caspase-3基因的表达,从而对铝致小鼠神经细胞凋亡产生抑制作用。     

乙酸铅诱发人肾小管上皮细胞线粒体损伤的体外研究

[目的]研究铅对人肾小管上皮细胞（human kidney cells,HK-2）线粒体的损伤作用,并探讨其可能的作用机制。[方法]以不同浓度的乙酸铅处理体外培养的HK-2细胞,罗丹明123（rhodamine 123,Rh123）及10-壬基吖啶橙（10-nonyl acridine orange,NAO）结合荧光化学发光仪分别检测细胞线粒体膜电位及心磷脂水平,细胞免疫荧光法结合流式细胞术检测线粒体细胞色素c（cytochrome c,Cyt c）释放情况,加甘露醇观察铅对心磷脂及Cyt c变化的影响。[结果]乙酸铅能造成HK-2细胞线粒体膜电位剂量及时间依赖性下降,荧光强度从正常对照组的4.56±0.25下降到400μmol/L组的2.90±0.26或从正常对照组的4.44±0.20下降到12 h组的2.34±0.50,与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。乙酸铅能明显造成HK-2细胞线粒体心磷脂NAO荧光强度时间及剂量依赖性下降,荧光强度从正常对照组的2.45±0.18下降到400μmol/L组的0.91±0.18或从正常对照组的2.52±0.01下降到24 h组的1.50±0.05,与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。乙酸铅能诱发线粒体Cyt c释放,剂量及时间依赖性地降低细胞内Cyt c荧光强度。50μmol/L甘露醇能使NAO荧光强度从1.38±0.14恢复至2.30±0.15,将Cyt c荧光强度从9.49±0.31恢复至14.20±0.39,明显抑制铅对心磷脂的氧化及Cyt c的释放。[结论]铅可能早期通过HK-2细胞线粒体膜电位溃散,造成线粒体功能损害,进一步加强线粒体心磷脂的氧化损伤,促使Cyt c释放,造成线粒体的结构损伤。     

滴滴涕与纳米二氧化钛对人胚肝细胞DNA损伤作用的协同效应

[目的]观察滴滴涕（DDT）及纳米二氧化钛（nano-TiO2）单独及联合体外染毒对人胚肝细胞株（L-02）内活性氧（ROS）含量及DNA损伤的影响。[方法]生长良好的L-02细胞,分别加入0.001、0.01、0.1μmol/L的DDT,0.01、0.1、1μg/mL的nano-TiO2,以及上述各浓度的DDT和nano-TiO2联合剂量,染毒时间均为24 h;运用DCFH-DA作为荧光探针,采用流式细胞检测技术检测DDT与nano-TiO2联合作用下L-02细胞内ROS含量,运用碱性和中性两种彗星试验检测各组DNA断裂损伤程度。[结果]0.01μmol/L以上浓度组DDT单独作用24 h引起ROS升高（P〈0.05）和DNA损伤增加（P〈0.05）;各浓度nano-TiO2单独染毒均不能引起DNA损伤增加（P〉0.05）,但1μg/mL单独染毒可引起ROS升高（P〈0.05）。各剂量组单独染毒24 h后均无明显的DNA双链损伤（P〉0.05）,但可导致DNA单链断裂损伤。析因分析结合反应曲面模型显示两种受试物联合染毒可协同增加ROS水平与DNA损伤作用（P〈0.05）。[结论]DDT和nano-TiO2联合作用可协同增加各自对DNA单链断裂水平的影响,诱导产生ROS导致DNA损伤是DDT和nano-TiO2引起机体损伤的主要机制之一。