Nogo-A蛋白在小鼠中枢神经系统中的表达及其意义

目的　确定髓鞘关联蛋白Nogo -A在小鼠中枢神经系统 (CNS)细胞水平的分布特点 ,探讨Nogo -A蛋白在脊髓损伤后在CNS神经纤维再生中的作用。　方法　用成年C57BL/ 6小鼠的大脑、脊髓、周围组织以及自由落体致伤的脊髓组织作为研究对象 ,采用免疫组织化学方法观察Nogo -A蛋白的表达特点 ;培养鸡胚E12DRG神经元 ,测定在Nogo -A作用下神经元的生长锥萎陷值。　结果　在小鼠CNS中 ,Nogo -A蛋白的表达主要位于少突胶质细胞及其胞突包绕轴突所形成的髓鞘中 ,在周围组织中无表达。脊髓损伤后 ,在损伤灶的周围Nogo -A的表达呈中度增强 ;Nogo -A组的神经元生长锥萎陷率达 70 % ,明显高于空白对照组和载体对照组 ,差异有显著性意义 (P <0 .0 5)。　结论　Nogo -A蛋白在小鼠CNS细胞水平的分布特点对于调控CNS神经纤维轴突的再生可能起重要作用     

siRNA对体外培养大鼠海马神经细胞NgR基因表达的抑制

目的 研究siRNA对体外培养的大鼠海马神经细胞NgR基因表达抑制作用,为进一步研究中枢神经损伤修复提供实验基础.方法 使用阳离子脂质体转染试剂将体外化学合成的针对NgR基因的siRNA转染体外培养的海马神经细胞,GAP43对培养细胞进行鉴定,分别于转染后48小时、1周收集转染细胞,提取总蛋白并定量.结果 海马神经细胞成功培养,转染48小时后NgR蛋白的含量为阴性对照组的45.11%,差异显著P＜0.05;转染1周后NgR蛋白的含量为阴性对照组的99.18%,差异不明显.结论 化学合成的针对NgR基因的siRNA在转染48小时后能显著下调NgR基因表达,但在转染1周后对NgR基因表达影响不明显.     

视神经横断对大鼠下丘脑视上核神经元Nogo-A/B及NgR表达的影响

目的 观察视神经横断对大鼠下丘脑视上核神经元Nogo-A/B及NgR蛋白表达的影响,并探讨下丘脑视上核神经元轴突再生长的可能调节机制.方法 12只正常成年SD大鼠随机分为两组(n=6),实验组大鼠行视神经横断术,对照组大鼠除视神经不横断外余处理均同实验组.手术7d后取大脑做冰冻组织切片,使用免疫荧光组织化学染色及激光共聚焦显微镜观察下丘脑视上核区神经元Nogo-A/B及NgR蛋白的表达情况.结果 对照组大鼠的视上核区域未见Nogo-A/B和NgR的特异表达.实验组大鼠视神经横断7d后,在视上核区域神经元可观察到Nogo-A/B及NgR蛋白的特异表达,两种蛋白基本分布在同一区域,位于细胞核周围.结论 Nogo-A/B和NgR参与了损伤后视上核神经元轴突的生长调节,但并非惟一的调节机制.可能是由于其他生长调节机制的存在,使得即使是在Nogo-A/B和NgR存在的情况下,损伤后视上核区轴突仍再生活跃.     

模拟失重对雌性大鼠背根神经节的影响

 目的 观察模拟失重对雌性大鼠背根神经节(dorsal rootganglion, DRG)的影响。方法 选取健康雌性大鼠80只,随机分为尾部悬吊实验组(n=40)和正常对照组(n=40)。实验组按照Morey-Holton教授提出的方法保持-30°头低位及后肢自由悬垂不负重的状态,各组大鼠按标准条件进行饲养。4周后取右侧L₅ DRG,HE染色观测DRG细胞形态,免疫组化观测髓鞘情况,电镜观测DRG髓鞘及线粒体超微结构。结果 HE染色结果显示,与对照组相比,实验组DRG细胞间隙轻度增宽,部分节细胞与卫星细胞分离。免疫组化结果显示,对照组免疫组化染色及IOD值(0.573±0.007)较实验组IOD值(0.802±0.009)降低(P<0.05),电镜下可见实验组髓鞘结构紊乱、松散,线粒体肿大、变形。结论 模拟失重可引起雌性大鼠DRG髓鞘及线粒体发生损伤性变化,推测模拟失重下可导致雌性大鼠DRG损伤。     

高压氧干预对绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养及增殖分化的影响CSCD

目的 探讨骨髓间充质干细胞培养及高压氧对其增殖分化的影响.方法 采用全骨髓细胞贴壁培养法提取绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞进行培养,取P3代骨髓间充质干细胞,用神经节苷脂和胶质细胞源性神经生长因子诱导液进行成神经元样细胞诱导,并在培养及诱导时进行高压氧干预,1次/d,为高压氧干预组（高压氧组）.采用免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）表达,绘制细胞生长曲线.未进行高压氧干预的为对照组.结果 贴壁培养法分离培养骨髓间充质干细胞,经多次换液后可纯化细胞.高压氧组间充质干细胞对数生长期提前,进入平台期后细胞数量多于对照组,高压氧干预后细胞于24 h内出现轴突、树突,48 h后2组对比,高压氧组80％以上细胞出现突起,且细胞突起较长、较粗.对照组突起的细胞比例不足80％,细胞分散,突起短,未连成网状.结论 骨髓间充质干细胞全骨髓贴壁培养法操作简单,细胞繁殖能力强,经高压氧干预后骨髓间充质干细胞生长加快.在细胞诱导时联合高压氧干预,细胞分化数量多,突起长.提示高压氧能促进体外骨髓间充质干细胞向神经元样细胞增殖和分化.     

Foxo3a在大鼠坐骨神经损伤后背根神经节中的表达

目的 探讨大鼠坐骨神经夹伤后Foxo3a在腰段背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)中的表达变化及其意义.方法 将42只成年SD大鼠完全随机分为正常对照组和实验组.对实验组行坐骨神经夹伤术.运用Western blot及免疫荧光染色,观察大鼠坐骨神经夹伤对腰段DRG中Foxo3a表达的影响及其与生长相关蛋白的表达变化.结果 Western blot结果表明,坐骨神经夹伤后1 d,腰段DRG中Foxo3a蛋白表达开始明显下降,第2天达到最低值,随之逐渐升高,于4周后接近正常水平.坐骨神经夹伤后2 d细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和神经元生长相关蛋白(GAP-43)在DRG中的表达均开始上调,在7 d达到最高点,GAP-43则保持较高水平.免疫荧光染色结果表明,Foxo3a表达下降主要存在于神经元和神经胶质细胞内,并且PCNA与神经元细胞几乎无共定位,与神经胶质细胞共定位明显.结论 大鼠坐骨神经损伤后,Foxo3a在腰段DRG中的表达减少可能与神经胶质细胞增殖和轴突再生密切相关.     

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

pDsRed1-N1基因核转染兔原代骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨以最近发展起米的核转染技术直接将编码红色荧光蛋白DNA质粒转染到兔原代骨髓基质细胞细胞核内进行基因修饰的可行性。方法从兔股骨抽取骨髓，密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以Nucleofectorw^TM技术转染pDsRed1—N1（DsRed组），以同期培养未转染的细胞作为对照组。测定细胞的活力、贴壁率、生长曲线以及转染的效率。结果在转染后48h成功发现DsRed的表达。两组细胞具有相似的形态学变化、贴壁率以及生长曲线。DsRed的表达逐渐增强，至第10天达到最高峰（54．2％），观察1个月未发现表达减弱。结论pDsRed1-N1基因核转染对兔原代骨髓基质细胞的体外增殖无明显影响；DsRed可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记；Nucleofector^TM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法。     

神经元损伤修复机制研究的离体模型--体外培养原代神经元损伤模型的建立及损伤后c-Fos蛋白表达

目的：建立一个模拟脊髓全横断损伤后脊髓组分——原代培养的脊髓神经元损伤的模型。方法：取Wistar大鼠(孕14d)脊髓，培养10～12d后，采用所设计的标准模板，直视下进行损伤。观察损伤前后不同时间神经元的形态及即刻早期基因c-fos的表达变化。结果：在损伤8～12h后，损伤两侧存活的神经元突起便开始朝着损伤部位生长，随着时间的延长，神经元突起甚至可跨越损伤处而延伸至对侧。c-fos基因在损伤后10min即有表达，2h达到最高峰，随后逐渐下降。结论：此模型可用于模拟体外培养的脊髓神经元受到机械损伤以及观察神经元损伤后进行修复的一些分子事件，简便而可靠，实用性较强。     

膝痹宁通过CPT1调节大鼠滑膜氧化还原稳态缓解膝骨关节炎疼痛的效应机制

目的 探讨膝痹宁通过肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT1)调节大鼠滑膜氧化还原稳态缓解膝骨关节炎(KOA)疼痛的效应机制。方法 提取大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞(FLS),采用CCK-8法筛选膝痹宁冻干粉干预FLS细胞的合适作用浓度。将FLS细胞分为对照组、KOA组、膝痹宁组,后两组采用5μg/ml脂多糖(LPS)诱导KOA炎症细胞模型,膝痹宁组加入100μg/ml膝痹宁,培养24 h。采用Real-time PCR和Western blotting检测CPT1、肉碱/有机阳离子转运体1(OCTN1) mRNA和蛋白的表达;采用试剂盒检测CPT1、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;使用2?,7?-二氯荧光素二乙酸酯检测活性氧(ROS)水平。提取大鼠背根神经节(DRG)神经元细胞,采用βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色进行鉴定。将收集的各组FLS上清加入DRG神经元中干预24 h,分别设为对照组、KOA组、膝痹宁组,采用Real-time PCR和Western blotting检测DRG神经元瞬时受体电位A1离子通道(TRPA1)m...     

经骨髓间充质干细胞诱导分化的神经样细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用

 目的 探讨经骨髓间充质干细胞诱导分化的神经样细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法 提取、培养和扩增骨髓间充质干细胞后,在体外诱导分化为神经样细胞。大鼠脊髓损伤造模后,分别进行神经样细胞、骨髓间充质干细胞及无细胞悬液移植,每组18只。术后采用BBB评分及斜板实验观察3组大鼠的运动功能恢复情况。结果 体外诱导骨髓间充质干细胞后,经免疫组化染色发现具备神经细胞特征。术后6周,BBB评分方面,实验组(16.56±2.42)优于阳性对照组(13.70±2.66),后者又优于阴性对照组(8.37±2.35)。Rivlin斜板实验评分方面,实验组术后2、4、6周,均优于阳性对照组,后者又均优于阴性对照组。实验组术后可见较多的神经纤维,结构完整,优于阳性对照组及阴性对照组。结论 体外诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化后,移植治疗大鼠脊髓损伤具有良好效果。
     

人参皂甙Rd对脊髓运动神经元抗谷氨酸损伤的作用观察

目的 探讨人参皂甙Rd对体外培养的脊髓运动神经元抗谷氨酸损伤的作用.方法 分离胎龄15d的SD大鼠的脊髓运动神经元,培养6d后分为4组:对照组,培养基中不加药液;谷氨酸(Glu)组,培养基中加入300μmol/L谷氨酸;人参皂甙Rd+谷氨酸(GSRd+Glu)组,培养基中预先加入10μmol/L人参皂甙Rd孵育30min,再加入300μmol/L谷氨酸;丙二醇+谷氨酸(Vehicle+Glu)组,培养基中预先加入等容量丙二醇孵育30min,再加入300μmol/L谷氨酸.继续培养24h,相差显微镜下观察神经元形态及生长状况,进行细胞计数,测定神经元存活率及培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性.结果 Glu组存活的脊髓运动神经元数目少,偶有突起形成,细胞受损严重;GSRd+Glu组脊髓运动神经元数目明显增多(P＜0.05),突起较多,只少数死亡细胞;Vehicle+Glu组神经元形态与Glu组相似.Glu组及Vehicle+Glu 组脊髓运动神经元存活率分别为22.7％±2.3％、23.6％±2.1％,明显低于对照组(l00％±0％,P＜0.05)及GSRd+Glu组(58.6％±2.3％,P＜0.05),而Glu组与Vehicle+Glu组比较、对照组与GSRd+Glu组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).Glu组及Vehicle+Glu组培养上清中LDH活性分别为142.50±3.55、139.20±2.75U/L,明显高于对照组(42.3±3.6U/L)及GSRd+Glu组(84.2±2.5U/L,P＜0.05),而Glu组与Vehicle+Glu组比较、对照组与GSRd+Glu组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 人参皂甙Rd对脊髓运动神经元抗谷氨酸损伤具有保护作用.     

两种荧光标记物对中枢神经系统内源性神经干细胞的标记效果比较

目的 观察DIL和DAPI两种不同的标记物对中枢神经系统内源性神经干细胞的标记效果.方法 清洁级健康成年SD大鼠36只,随机分为实验组(DIL组,DAPI组)和对照组(DMSO组,PBS组).使用立体定位仪,向实验组大鼠侧脑室注入0.2％ DIL或10μg/ml DAPI各10μl,对照组大鼠侧脑室相应注入DMSO或PBS各10μl.注射后2h和24h对动物进行神经功能损伤评分(NSS).采用激光共聚焦显微镜观察注射后1、3、7d脑室及脊髓颈、胸、腰段室管膜细胞的荧光标记情况,对目标区域荧光强度进行半定量分析,并对不同组别和时间点的脑室及脊髓标本测定结果进行比较.结果 注射DIL及DAPI后2h,大鼠NSS评分很低,与相应对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05),24h后基本恢复正常.DIL注射后1d,侧脑室及各节段的脊髓室管膜细胞胞质均显示红色荧光,一直持续到注射后7d.DAPI注射后1d,侧脑室内标记的细胞核形态清晰,呈蓝色,脑室脉络丛大量细胞亦可见蓝色荧光标记,但脊髓各节段室管膜区的细胞均未见蓝色荧光,注射后3、7d的情况与1d类似.两种试剂标记后,目标区域内各时间点的荧光强度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DIL可对内源性神经干细胞的细胞质进行标记,适合作为侧脑室和脊髓室管膜内源性神经干细胞的标记物.DAPI可标记细胞核,适合用于侧脑室内源性神经干细胞的标记.脑室注射荧光染料对动物影响小,是一项相对安全的操作.     

聚左旋丙交酯纳米纤维联合骨髓间充质干细胞修复大鼠脊髓损伤的效果

 目的 探讨聚左旋丙交酯纳米纤维联合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果。方法 在体外,制备材料和提取干细胞后,将骨髓间充质干细胞种植于聚左旋丙交酯纳米纤维材料上,通过CCK-8法观察材料上干细胞的增殖情况,在维甲酸的诱导分化后,通过光镜和免疫组织化学方法观察材料上干细胞的神经分化。在体内,制备成大鼠脊髓损伤的模型后,分别移植有干细胞黏附的聚左旋丙交酯纳米纤维膜(联合组)、聚左旋丙交酯纳米纤维膜(纤维膜组)、骨髓间充质干细胞(干细胞组),以及空白植入(空白对照组)。术后2、4、8周对大鼠进行BBB功能评分,观察大鼠脊髓损伤修复的效果。结果 体外研究观察发现,在聚左旋丙交酯纳米纤维材料上的干细胞与普通培养皿中的相比,第1、4天未见明显差异,第7天材料上的干细胞增殖好于普通培养皿中的。在纤维材料上的干细胞向神经样细胞的诱导分化也好于普通培养皿中的。体内实验发现,术后4周,联合组、纤维膜组与干细胞组之间未见明显差异,均优于空白对照组,术后8周,联合组优于纤维膜组及干细胞组,且均优于空白对照组。结论 聚左旋丙交酯纳米纤维联合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤效果良好。     

移植分泌神经营养因子-3的人胚神经干细胞对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响

目的探索Lentivirus介导神经营养因子(NT-3)转染的人胚神经干细胞(human neural stem cells,hNSCs)对大鼠损伤脊髓治疗机制和治疗的作用机制。方法在体外用Lenti- virus构建同时表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)和NT-3的hNSCs,将其移植到T_(10)脊髓半横断损伤的大鼠体内,用荧光显微镜和BBB评分观察体内转基因表达和大鼠功能恢复情况,用免疫组化染色检测移植细胞在体内存活分化情况。结果(1)在体外用Lentivirus成功构建了同时表达多基因的人胚基因工程NSC并检测到了稳定的转基因表达;(2)用荧光显微镜可以检测到到hNSC,能在体内长时间存活并表达转基因;(3)BBB评分检测到hNSCs移植组大鼠后肢功能有明显恢复;(4)移植的基因工程hNSC能在体内分化为神经元及星形胶质细胞等功能细胞。结论Lentivirus介导NT-3转染的hNSC能够调整损伤的局部微环境促进损伤脊髓的功能恢复。     

高压氧对大鼠脊髓损伤后Fas/Fas1及Caspase-3表达与细胞凋亡的影响

目的 观察高压氧对大鼠脊髓损伤后Fas/Fas1、Caspase-3和凋亡细胞的影响,探讨高压氧治疗脊髓损伤的机制.方法 按照Allen's打击法制备SD大鼠脊髓损伤模型,将20只大鼠损伤后随机分为高压氧组、常氧高压氮组、常压吸氧组和常压空气组,于损伤后6 h开始治疗;1、2、 3、 7、和11 d取材.采用凋亡细胞检测法检测凋亡细胞,免疫组化法检测Fas/Fas1和Caspase-3表达,光镜下观察并计数分析.结果 Fas/Fas1、Caspase-3和凋亡细胞于损伤后1 d即升高,Fas/Fas1和Caspase-3于伤后2 d即达到高峰,细胞凋亡高峰出现在第3天,高压氧组与各组比较,峰值降低且差异有统计学意义(P<0.01).结论 高压氧对大鼠继发性脊髓损伤有保护作用,其作用与下调Fas/Fas1的表达,减少Caspase-3,从而抑制细胞凋亡有关.     

高压氧预处理对脊髓神经元氧化损伤中超氧化物歧化酶和血红素氧合酶-1的影响

目的 研究高压氧(HBO)预处理诱导脊髓神经元氧化耐受的机制.方法 取胚胎小鼠脊髓行原代神经元培养,分为正常对照组和HBO预处理组(HBO组).利用Westem Blot、RT-PCR等方法,观察HBO预处理对脊髓神经元抗氧化酶水平的影响.结果 HBO预处理前后超氧化物歧化酶(SOD)表达无统计学差异,血红素氧合酶(HO-1)在处理后表达增多.行RT-PCR检测HBO处理前后HO-1 mRAN水平,发现在预处理后4 h开始明显增多,处理后8 h表达达到高峰,直至处理后24 h其表达量仍比预处理前高.结论 HBO预处理对脊髓神经元氧化损伤的保护作用可能与诱导HO-1表达有关.     

Nogo-66受体单链RNA干扰对大鼠脊髓半切损伤的治疗效应

目的 观察Nngo-66受体(NgR)单链RNA干扰(siRNA)对大鼠脊髓半切损伤的治疗效应. 方法 建立大鼠脊髓半切损伤模型,脑室内注射筛选出的有效NgR siRNA,采用运动功能评分、辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪、HE染色等方法,评价NgR siRNA对损伤脊髓的治疗效应. 结果 神经功能评分示,从第4周起,siRNA治疗组的运功功能恢复好于等渗盐水组和空白对照组,但差异无统计学意义.HRP逆行神经示踪示,治疗组多数可于脊髓前角见较多的标记细胞,与等渗盐水组和空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).HE染色示脊髓损伤后8周,等渗盐水组和对照组的损伤区纤维排列紊乱,siRNA组部分大鼠损伤区见有较连续的纤维通过.结论NgR siRNA可促进脊髓损伤后的神经再生修复.     

Lentivirus介导神经营养因子-3促进脊髓损伤大鼠功能恢复

目的探讨Lentivirus介导分泌神经营养因子-3(NT-3)直接体内转基因治疗大鼠脊髓损伤作用和机制。方法将28只Wistar大鼠在T10水平制成半横断损伤模型,随机分为体内转基因治疗组和损伤对照组,每组14只;用携带NT-3和绿色荧光蛋白(GFP)的Lentivirus对大鼠行直接体内转基因治疗;荧光显微镜观察体内转基因表达,后肢运动功能评分法(BBB评分)检测大鼠后肢功能恢复情况。结果用荧光显微镜检测到损伤脊髓内有较多的持续表达转基因的细胞;BBB评分结果显示,从伤后第4周开始,实验组大鼠后肢功能较对照组明显恢复(P<0.01),至第10周时,实验组和对照组BBB分差增大,达3.3分。结论Lentivirus是一种有效的转基因载体,由Lentivirus介导分泌NT-3的直接体内转基因治疗能够明显促进损伤脊髓的功能恢复。     

胚胎大鼠背根神经节神经元的培养与纯化

目的建立一种简单可行的胚胎大鼠背根神经节神经元培养和纯化方法。方法取胚胎大鼠背根神经节，通过胰蛋白酶消化、抗有丝分裂药物纯化等方法获得背根神经节神经元。采用降钙素基因相关的缩氨酸和神经丝蛋白双重免疫细胞化学染色法鉴定并测定神经元的纯度。结果分离培养的背根神经节神经元在适宜的培养基中生长良好，纯度可达到93％左右。结论此培养方法简单、易行，能培养和纯化出大量背根神经节神经元。