登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析

目的扩增登革病毒2型新几内亚株(NGC)E基因,并进行B细胞抗原表位分析。方法根据登革2型病毒NGC株E基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增NGC株E基因并克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α后测序。按Kyte-Doolit-tle方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案预测B细胞抗原表位。结果通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,并对登革2型病毒NGC株E基因进行B细胞抗原表位预测。结论通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗打下基础。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达

目的:构建登革2型病毒NGC株E基因区1～476 bp的原核表达载体并进行原核表达.方法:将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-En;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的TCID50.结果:(1)成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,相对分子量约为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合;(2)用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%;(3)DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1 ml.结论:pET28a(+)-En可在BL21(DE3)菌株中高效表达,DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用.     

登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定

目的 构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆，为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物，从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段，并克隆至pCR—XL—TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明，获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。     

两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的 :对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever ,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特证。方法 :利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果 :B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt(4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 1 0 0 …     

白纹伊蚊垂直传播登革病毒后E基因区部分序列的变化

目的：通过对登革病毒经垂直传播后亲代和子一代蚊体内病毒基因序列的分析，了解登革病毒在流行过程中的变异性。方法：用登革2型病毒(DEN-2)NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株，提取亲代及子一代蚊体内病毒总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增蚊体内DEN-2病毒核酸，对阳性聚合酶链反应(PCR)产物进行序列测定和比较。结果：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株后，子一代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区序列与亲代蚊体内扩增的序列比较，出现3个位点的突变，分别位于第174，215，336位点；亲代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区部分序列与DEN-2 NGC株E基因区序列相同。结论：DEN-2在垂直传播后出现病毒E基因区的点突变。     

用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸

目的：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法。方法：分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸(RNA)，合成CD-NA第一链，经过RT-PCR得到cDNA产物，用HinfI限制性内切酶酶切鉴定。结果：通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸。结论：登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法。     

佛山市登革2型病毒流行株结构基因序列测定及分析

目的对我国登革2型病毒1993年广东省佛山市流行株GD06/93结构蛋白基因进行序列测定及分析,追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系,为研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT-PCR扩增,分别克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果GD06/93株结构基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株TSV01、Taiwan-1008DHF、NGC、44、ThD2_0038_74、ThNH81/93、gd08/98、04、Cuba165/97及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为97%、96%、95%、95%、95%、94%、94%、92%、92%、91%。结论GD06/93病毒株的结构基因序列与已发表的其它登革2型病毒株同源性很高。在比较的6株登革2型病毒株中,GD06/93株与同期在澳大利亚流行的TSV01株同源性最高。     

1株2019年云南省西双版纳流行登革热1型病毒全基因组序列分析

目的 了解2019年西双版纳暴发登革热主要流行血清型登革热1型病毒（Dengue virus-1, DENV-1）分子特征，为当地登革热流行的预防控制提供依据。方法 在C6/36细胞上对1株从2019年西双版纳发热患者血液中分离到的DENV-1病毒（JHS45）进行复壮，采用二代测序的方法对该株病毒进行测序，采用CLC Genomics workbench 8.0生物信息学软件对测序数据组装，使用Lasergene软件、MEGA6.1等进行序列比对、系统进化树构建及氨基酸位点分析。结果 JHS45株病毒在C6/36细胞上6 d出现细胞病变。测序组装后获得JHS45株病毒1条10 687个核苷酸（nt）长序列（GeneBank登录号：OR593353）。遗传进化分析结果 JHS45株病毒与我国2019年西双版纳、广州、河南、浙江流行的以及2013年泰国流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒形成一个进化分枝，核苷酸同源性为97.6%～99.9%，氨基酸同源性为99.1%～100%；分析发现与2019年云南西双版纳（MW386863）和广州（MW261839）流行的DENV-1基因型Ⅰ病毒位于同一个...     

海南省2019年9例登革病毒的鉴定及E基因序列分析

目的 对2019年海南省暴发的16例疑似登革热（dengue fever, DF）患者血清标本进行调查研究,从分子水平对登革病毒（Dengue virus, DENV）的E基因进行分析,对此次登革病毒进行鉴定,并对登革热的防控给出可行性意见。方法 对患者血清进行核酸检测、分型,将登革病毒阳性标本进行分离及核酸检测,利用实时荧光定量PCR技术对病毒进行分型,通过RT-PCR扩增E基因片段RT-PCR产物经过琼脂凝胶电泳成像系统观察条带结果,根据条带的有无判断阴性或阳性,根据条带的大小判断登革病毒的型别,得到9条DENV-1型E基因序列,基因测序之后与2019年中国其他省、国外选取的共11条DENV-1型E基因序列进行比较中,通过MEGA7.0.26软件从分子水平进行同源性比较以及系统进化树构建。结果 通过血清学鉴定结果以及实时荧光定量PCR技术检测得出的Ct值,可知研究的16份患者血清中,有9份经过鉴定为DENV-1型,7例为阴性结果。系统进化树表明,2019年海南9例DENV-1病例与参考序列MK517727 Guangzhou 2019、MK517719 Guangzhou 2019、MK517720 Guangzhou 2019同源性最高为99.73%~99.80%,与3株作为参考序列的外源株,序列相似度都相对较低,结果可靠。结论 得到的E基因长度为1 485 bp,2019年海南省9株DENV-1型为输入型流行株,根据进化树亲缘性分析,此次海南DENV-1病例与广州省的登革病例同源性最高。     

登革病毒2型prM蛋白的表达及其抗体的ADE作用研究

目的建立登革病毒2型（DENV-2）前膜蛋白（prM）的原核稳定表达系统,并制备prM多克隆抗体,研究登革病毒特异性prM抗体的中和作用及抗体依赖性感染增强作用（ADE）。方法应用大肠杆菌表达系统表达全长DENV-2prM蛋白,经电洗脱法纯化重组蛋白,免疫家兔,制备兔抗prM蛋白多抗;应用空斑减数中和试验（PRNT）和流式细胞术（FCM）分别检测prM兔多克隆抗体的中和作用和ADE效应。结果重组prM蛋白在原核系统可获得高效表达,prM蛋白的表达量占大肠杆菌全菌蛋白的15％左右;其免疫血清经Westernblotting法证实为登革病毒特异性prM多克隆抗体,用ELISA法检测效价为1：800000。PRNT表明,prM抗体对成熟和不成熟DENV．2感染C6／36细胞中和作用有限,最大中和程度分别为49．84％和50．22％;FCM结果表明,prM抗体能在较大的抗体稀释度范围（10-2～10-6）增强成熟和不成熟DENV-2感染,且在10。稀释度时达到最高峰。结论重组DENV-2prM蛋白有很强的免疫原性．其诱生的prM抗体对登革病毒仅有较弱的中和活性,但却呈现出较强的ADE作用,揭示prM抗体是一种感染增强性抗体。     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

蟹多拷贝重组金属硫蛋白的原核表达载体构建及表达

目的：在大肠杆菌BL-21（DE3）PlysS中表达中华绒螯蟹金属硫蛋白基因多拷贝串联重组基因.方法：将中华绒螯蟹金属硫蛋白（MT）基因通过PCR方法引入适当的限制性内切酶位点,通过T-A克隆,双酶切得到两端含内切酶位点的各单拷贝片段,再逐一利用引入住点插入到pET-15b原核表达载体中,载体转化大肠杆菌BL-21（DE3）PlysS,经过酶切和测序鉴定验证,得到含重组质粒的工程菌.结果：成功构建了与His标签融合表达的含2拷贝和3拷贝中华绒螯蟹金属硫蛋白基因的重组质粒.摸索了不同的pH、IPTG、温度条件、锌离子浓度、菌体OD值、诱导时间后,选择最佳条件,成功高效地表达了与His融合的2拷贝和3拷贝的金属硫蛋白,目标蛋白表达量分别占菌体总蛋白的40%和45%.结论：成功制备了金属硫蛋白的工程菌并获得高效表达目标蛋白,为金属硫蛋白的科学研究和工业化大规模生产应用打下了坚实的基础.     

广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析

目的：对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株（71/02GZ）进行全基因组测序和系统进化分析。方法：采用C6/36细胞培养71/02GZ,分别采用RT-PCR,5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列,PCR产物克隆到载体并测序,拼接成全基因组序列,分别基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt进行系统进化分析。结果：71/02GZ株基因组全长10 735 nt,两端非编码区（NCR）长度分别为94 nt和462 nt。基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt的进化分析结果显示71/02GZ株和2002年广州分离株（GZ01/02,GZ/218/2002）,1995年广东分离株（GD23/95,GD01/95）、1995年广州分离株（GZ01/95）组成一个基因型;而1999年广东分离株（GD05/99）,1997年广东分离株（GD14/97）和1980年广州分离株（GZ/80）属于另一个基因型;另外,71/02GZ株同1998年印度尼西亚分离株（98901530 DF DV-1-ID）的同源性最高。结论：71/     

228株结核分枝杆菌MLVA分型研究

目的：通过多位点可变数目串联重复序列（MLVA）分型,了解甘肃省临床分离结核分枝杆菌菌株基因型情况。方法：选择标化的15个VNTR位点,对临床分离菌株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用BioNumerics4.5软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果：228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个主要基因型,分别包含13（5.7%）、3（1.3%）、7（3.1%）、1（0.4%）、171（75.0%）、31（13.6%）、2（0.9%）个菌株;在株水平基因分型上,93（40.8%）株为独立基因型;其余菌株基因型分别包含2～10株结核分枝杆菌,共构成132个基因簇。结论：甘肃省临床分离结核分枝杆菌菌株存在丰富的基因多态性,MLVA方法具有较高的基因分型能力,可以满足结核分枝杆菌株水平DNA分型的需要。甘肃省临床分离结核分枝杆菌菌株主要为北京家族基因型菌株。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的临床分离及耐药机制分析

目的：了解我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IRPA）的临床分布情况,并探讨其耐药机制。方法：对2009年1月～2010年12月我院住院患者临床分离的非重复性IRPA的数据资料进行统计分析,采用PCR方法检测金属酶基因和外膜通道蛋白基因。结果：从404株铜绿假单胞菌中共分离出100株IRPA,分离率为24.75%。其中90株（90.0%）IRPA来源于下呼吸道痰液标本;IRPA主要来源于重症医学科（ICU）;IRPA对阿米卡星最敏感率为73.0%（耐药率为27.0%）,其次是哌拉西林/他唑巴坦（敏感率为63.0%）,哌拉西林（敏感率为59.0%）,庆大霉素（敏感率为58.0%）,头孢他啶（敏感率为57.0%）,其余药物的敏感率均〈50.0%。仅1株IRPA检测出IMP基因阳性（1.0%）,测序为IMP-9型金属酶基因,其余金属酶基因均未检出;oprD2基因缺失的IRPA有65株（65.0%）。结论：我院IRPA主要是由于外膜通道蛋白oprD2缺失引起,且已有IMP-9型IRPA在我院流行,需引起重视。     

新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析,为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条,运用MEGA5．2．1软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化;应用Excel表格对氨基酸构成进行计算;运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别,系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成,系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株,并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后,这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。     

精胺对内皮细胞损伤的作用机制初探

目的观察高浓度外源性精胺(Sp)对传代培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的损伤作用,并初步探讨其可能机制。方法采用传代培养的方法,观察较高浓度精胺(5.0 mmol/L)作用2 h时引起HUVEC的损伤,分别给予一定的保护剂维拉帕米(VP)、超氧化物岐化酶(SOD)、维生素E(VE)进行预保护。观察指标:①倒置显微镜下观察HUVEC形态学变化;②透射电镜观察HUVEC超微结构改变;③细胞活力(MTT)测定;④MDA含量测定;⑤SOD活性测定;⑥过氧化氢酶活性(CAT)测定。结果通过检测各组细胞MTT活性,检测细胞培养液中SOD、MDA及CAT活性,以及借助倒置显微镜观察内皮细胞形态和透射电镜下对内皮细胞超微结构的观察,均证实3种保护剂可以明显减轻精胺引起的内皮细胞损伤。加入保护剂的3组细胞,其MTT、SOD、MDA及CAT活性值,与精胺组比较,差异显著(P<0.05),细胞损伤有所减轻。结论高浓度的外源性精胺引起HUVEC损伤,其作用机制可能与细胞内钙超载、氧自由基大量产生导致的细胞膜脂质过氧化有关。