荧光素酶光学成像技术研究进展

活体动物体内光学成像技术的主要功能是追踪并检测标记细胞、微生物及分子在体内的活动和表达情况.该技术可以非侵入性地连续检测活体动物体内的生物学活动,其灵敏度高,使用方便、迅速,已被广泛应用于众多研究领域.就荧光素酶(Luc)光学成像技术的原理及应用进展作一综述.     

体内荧光活体成像观察miR-581 对结直肠癌细胞SW620 转移能力的影响

目的:采用动物活体荧光成像技术体内动态观察miR-581对结直肠癌(CRC)细胞SW620转移能力的影响。方法:构建并筛选出荧光素酶标记的SW620稳转株(miR-581-NC-Luc、miR-581-UP-Luc),分组尾静脉注射于裸鼠体内,实时荧光成像系统动态观察其在体内成瘤大小和转移部位情况。切取裸鼠转移器官组织行HE染色、免疫荧光等检测。结果:成功构建稳定表达荧光素酶的CRC SW620细胞,建立了裸鼠CRC异位转移瘤模型;从实验组和对照组裸鼠的总转移率、转移灶个数、转移区域内荧光表达量等多方面对比得出,与阴性对照组相比,miR-581过表达组SW620细胞在裸鼠内肺转移能力显著下降(P0.05)。结论:本研究通过活体成像系统间接反映肿瘤在体内的生长情况,使在不触及肿瘤的情况下对动物移植瘤模型的研究成为可能,为深入研究miR-581对CRC肿瘤细胞转移能力的影响提供体内证据。     

鹿角胶体内分布及入血入骨成分的示踪动力学分析

背景：课题组前期研究发现鹿角胶小分子肽能够促进骨生长，对于治疗骨类疾病具有良好的应用前景。然而鹿角胶如何在体内发挥作用以及原理尚未明确。目的：荧光标记及活体示踪技术研究鹿角胶体内靶器官分布动向。方法：使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)对鹿角胶进行荧光标记，通过荧光成像、紫外光谱扫描检测标记结果。将标记成功的鹿角胶，通过灌胃注入小鼠体内，通过激光共聚焦显微镜检测鹿角胶吸收入血情况，应用小动物活体成像仪检测鹿角胶在小鼠体内的分布情况。在血清及骨内荧光最强时间点取材，对血清及骨组织蛋白液进行凝胶电泳，通过二级质谱检测确定吸收入靶器官的鹿角胶成分。结果与结论：(1)葡聚糖凝胶色谱成功分离荧光标志物，荧光成像及紫外光谱扫描证明标记成功，并测得FITC-鹿角胶的荧光取代度为0.953%;(2)入血成分荧光强度检测结果显示口服2 h后鹿角胶在血清中分布最多；(3)不同时间小鼠的双侧股骨与胫骨荧光成像显示相同，证明鹿角胶可通过入骨发挥作用；(4)二级质谱检测对比UniProt数据库发现该肽段为核心蛋白聚糖的特征片段，证明鹿角胶中的核心蛋白聚糖可进入骨内...     

量子点标记技术在动物体内的研究进展

量子点本质上是一种半导体纳米微晶体，是近年来出现的一种新型荧光标记物。与传统的有机荧光标记物比较，量子点亮度大、稳定性好及发射光波长较长并易于调控，作为一种荧光探针不仅为单个细胞的研究及成像提供了新的手段，更为在动物活体内开展研究提供了新的标记方法。重点概述量子点的生物特性及其在动物体内研究的有关进展。     

利用光学成像系统非侵入性监测乳腺癌细胞在骨环境内的生长情况

目的应用稳定表达红色荧光蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231SArfp细胞系,建立乳腺癌骨移植瘤动物模型,并应用活体成像技术检测肿瘤的生长情况。方法注射MDA-MB-231SArfp细胞于BALB/c雌性裸小鼠胫骨髓腔,应用活体光学成像系统,连续观察肿瘤细胞在体内的生长情况,同时测量肿瘤体积的变化;4周和7周时拍摄X线片并做组织学检查,评估肿瘤对骨组织的影响。结果利用活体光学成像系统监测发现,至第3~4周期间,肿瘤进入对数生长期;肿瘤大小与荧光信号强度呈线性正相关。X线片和组织切片显示MDA-MB-231SArfp细胞形成溶骨性的骨破坏。结论成功建立了可非侵入性监测的乳腺癌骨移植瘤模型,利用活体光学成像系统结合X线片及组织学检查能够直观、连续、准确地检测肿瘤细胞在骨环境内的生长情况,为后续抗肿瘤药物的筛选和评价提供了新的手段和工具。     

小鼠双光子激光扫描显微镜活体成像窗口构建技术

双光子显微成像技术以其组织器官穿透性深、光漂白及光毒性低等独特优势,成为小动物活体光学高分辨显微成像的重要工具;但是活体状态下,由于动物的呼吸、心跳以及一些组织非自主的蠕动等使观察视野无法固定,导致图像失焦,降低实验的可重复性。成像视窗以其支持原位、实时观察及长期成像等优势,已成为双光子活体成像的重要辅助手段之一。本文主要介绍了小鼠不同脏器活体成像固定装置的设计、成像视窗的构建方法以及成像窗口在实际应用中需注意的问题等,旨在为使用者提供更多的方法参考,解决活体成像图像稳定度低、清晰度差等问题,拓宽实验种类,提高观察深度和精度。     

生物发光技术在活体成像检测中的应用

生物发光体内成像检测技术已广泛应用于许多动物实验中,其优势在于可对特定的细胞和分子行为进行非侵入性的体内评价和连续动态研究,这些细胞和分子往往是药物作用或基因治疗的靶点。该技术有效减少了所需实验动物的数量,也减小了因个体差异引起的误差,改进了数据点的质量。     

小鼠颅骨视窗及其在光学活体脑成像研究中的应用

小鼠颅骨视窗作为一种活体光学脑成像辅助工具,以其原位表征、实时观察、长期活体脑成像等优势,成为脑部疾病及神经元突触生长等研究的重要手段之一。小鼠颅骨视窗不仅可以对颅骨下软脑膜血管及血管内红细胞流速、流态变化进行定量分析,在结合荧光标记物与光学显微镜后,还可以对脑部皮层下组织、神经细胞的变化进行清晰成像。过去数十年,科研人员利用小鼠颅骨视窗深入研究了偏头痛、阿尔兹海默症、神经突触等病理生理过程,并取得了大量突破性进展。同时,随着光学成像工具性能的提升,小鼠颅骨视窗的应用也得到了进一步拓展。本文主要介绍颅骨视窗的发展史、构建方法,结合荧光探针及光学成像方法的研究,全面总结了近年来小鼠颅骨视窗在光学脑成像研究中的应用,包括脑内重要生物分子成像、细胞成像、血管及血流成像、神经环路可塑性及神经功能成像、疾病发生机理及药物开发研究等,最后讨论了小鼠颅骨视窗在实际应用中面临的问题,并对其未来应用进行了展望。     

Mito-cpYFP cDNA转基因小鼠的建立及其自由基分布规律的初步探讨

目的:利用可实时动态测量超氧阴离子自由基的环状排列黄色荧光蛋白(circularly permuted yellow fluorescent protein,cpYFP)构建可实时动态监测活体动物体内自由基的转基因动物模型。方法:应用转基因技术将载有可定位于线粒体内的cpYFP(mitochondria-targeted cpYFP,mito-cpYFP)的载体pRP(Exp)-CAGGmitocpYFP注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,采用PCR及RT-PCR的方法鉴定阳性小鼠,通过荧光观察自由基的分布并辅助鉴定阳性小鼠。结果:PCR、RT-PCR及荧光观察结果表明mito-cpYFP cDNA转基因小鼠构建成功。通过与野生型C57BL/6小鼠交配,得到F1、F2和F3代的新生幼鼠共计494只,其中,阳性幼鼠为255只,阳性率为51.6%。转基因阳性鼠体内出现了绿色荧光,其解剖伤口、肠道、脑部及口腔黏膜等荧光明显,而肾脏、肝脏及胸腺等荧光则较弱,耻骨联合部和膀胱出现绿色荧光,但约0.5 h后消失。结论:我们成功制备了可稳定表达并遗传mito-cpYFP的转基因小鼠品系。在活体动物体内,自由基在黏膜层含量较多。此模型可研究自由基在生物体内的含量及分布规律,为后续生物自由基作为信号分子在机体内传导途径的研究提供有效的工具。     

现代显微成像技术及其在细胞生物学中的应用

具有高分辨率、能活体观察和三维成像的现代显微成像技术的产生和发展,为细胞生物学研究提供了有效的工具。我们在本文中阐述了几个重要的现代显微成像技术原理和技术要点以及在细胞生物学中应用的现状,包括光学显微术、电子显微术和荧光探针技术及相关技术,并对现代显微成像术的发展进行了展望。     

量子点探针对人肝癌裸鼠模型的体内靶向成像研究

目的研究量子点标记靶向探针对人肝癌裸鼠模型的体内成像技术。方法将巯基乙酸修饰的水溶性量子点结合鼠抗人甲胎蛋白（AFP）单克隆抗体制备成水溶性量子点-AFP-Ab复合物探针。荧光、紫外光光谱分析及透射电镜研究其特性。通过直接免疫荧光法,用该复合物探针特异性识别肝癌细胞株HCCLM6 AFP抗原。将体外培养的肝癌细胞株HCCLM6通过皮下接种和尾静脉注射裸鼠分别建立人肝癌裸鼠模型和肺转移模型。尾静脉注射量子点-AFP-Ab探针,用蓝光二极管照射获得活体荧光成像;用掺Ti蓝宝石激光器照射,对肿瘤部位和正常部位进行光谱分析。取血清检测丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、尿素氮和肌苷水平。取裸鼠肝、脾、肾、肺、心和脑6种主要实质性器官行振荡切片,共聚焦显微镜观察,研究量子点-AFP-Ab探针在裸鼠体内的非特异性摄取。结果量子点-AFP-Ab复合物探针具有激发光谱宽、荧光强度高的特点,能特异性与肝癌细胞AFP抗原高亲和力结合,在体内能特异性靶向肿瘤组织进行活体成像,无明显急性毒性。光谱分析显示量子点-AFP-Ab复合物探针主要分布于肿瘤的外周部位,少数该探针被肝、脾和肺非特异性摄取。结论量子点-AFP-Ab复合物探针具有优良的光学特性和生物相容性,能够进行肝癌体内靶向成像,将有助于肝癌的分子靶向研究。     

硫化铅量子点辅助近红外二区荧光成像技术在活体应用中的研究进展

近红外二区（NIR-Ⅱ, 900～1 700 nm）的光相较于传统可见光（400～700 nm）和近红外一区（NIR-Ⅰ, 700～900 nm）的光,波长更长,生物组织内传播时散射更小。因此,NIR-II荧光成像技术在活体生物组织内具有深层穿透能力和高时空分辨率成像等优点。发射NIR-II荧光的纳米探针备受研究者们的关注,其中硫化铅（PbS）量子点凭借尺寸可调、波段可调、易被修饰和量子产率高等优势成为生物医学活体成像的研究热点,如心脑血管和肿瘤等多种疾病的动物造影实验。本文介绍PbS量子点的荧光特性和合成方法,概述NIR-II窗口下PbS量子点基于多种物质的修饰,在胃肠道、血管、肿瘤、淋巴结等生物活体组织内荧光成像的应用,为探索该成像模式下未来发展潜力做铺垫。     

T细胞运载金纳米粒子活体成像的初步实验

目的为直观评价过继免疫疗法的疗效,尝试用电穿孔法将显像剂标记的金纳米粒子（AuNPs）导入T细胞,再对T细胞进行活体成像。方法3只雄性BALB/C-nu/nu裸鼠,6周龄,体质量18～22 g。①以氨羧络合剂（DTPA或DOTA）对AuNPs的表面进行改性,再用聚乙二醇（PEG）修饰,最后对AuNPs进行111In或64Cu标记。②通过电穿孔法将AuNPs导入正常人T细胞。③将含111In标记AuNPs的T细胞直接注射到裸鼠1肺内,采用微型单光子发射计算机断层成像术（micro-SPECT）/CT对其活体成像。再以微型正电子发射断层成像术（micro-PET）/CT对含有64Cu标记AuNPs的T细胞于裸鼠2及64Cu标记AuNPs于裸鼠3体内生物学分布进行活体成像。结果电穿孔法将111In标记的AuNPs导入T细胞后直接注射入裸鼠1肺内,以micro-SPECT/CT对其成像,结果为阳性,裸鼠1右肺内见高摄取区。用正电子核素64Cu标记AuNPs,同时尝试各种电转条件以进一步提高转染效率（2.3×105AuNPs/cell）和细胞存活率（65.4%）,经尾静脉注射入裸鼠2体内,micro-PET/CT于注射后立刻成像、注射后2 h及18 h分别成像,清晰地显示含有64Cu标记AuNPs的T细胞在正常裸鼠2体内的动态生物学分布。作为对照,同时对64Cu标记的AuNPs本身于裸鼠3体内活体成像,发现含有AuNPs的T细胞与AuNPs本身的生物学分布显著不同。结论初步研究表明运载显像剂标记AuNPs的T细胞活体成像是可以实现的。     

高光谱成像医学诊断的探讨

目的:高光谱成像是一个新兴的,非破坏性的,先进的光学技术,它具有光谱和成像的双重功能,这种双重功能使得高光谱成像能够同时提供实验对象的化学和物理特征,并具有良好的空间分辨率。文章探讨利用高光谱成像技术进行医学诊断的潜力及前景。方法:首先介绍高光谱成像原理及特点,并综述高光谱成像技术在医学诊断方面的研究进展,具体从体表组织和器官的原位医学高光谱成像诊断、体内组织和器官的离体医学高光谱成像诊断、病理学切片及细胞显微高光谱成像医学诊断和光纤高光谱成像活体医学诊断四个方面进行了详细介绍。结果:高光谱成像作为一种特殊光学诊断技术,具有成像系统多样化、研究对象广泛化、临床诊断实用化和分析方法功能化等特征。结论:高光谱成像技术具有原位实时活体诊断疾病(特别是肿瘤)的潜力,临床应用前景广阔,值得深入研究。     

肝原位移植瘤裸鼠模型的建立及活体荧光成像检测

目的 建立能够通过活体荧光成像系统实时监测肿瘤进展的肝原位移植瘤裸鼠模型.方法 重组质粒pcDNA3.1-Luc转染细胞构建稳定表达荧光素酶的PLC/PRF/5肝癌细胞株,将该细胞注入裸鼠肝脏实质内,应用活体成像技术动态监测肿瘤进展情况,解剖荧光信号阳性裸鼠观察肿瘤组织生长情况.免疫荧光检测肿瘤组织中HBsAg表达.结果 对裸鼠肝原位移植瘤应用活体荧光系统成像,在肿瘤细胞注射部位检测到荧光信号,解剖动物后可在肝脏组织中观察到异质细胞团块.免疫荧光证实移植瘤中有HBsAg表达.结论 肝脏原位移植瘤裸鼠模型建立成功,为抗肝癌药物的研发提供了工具.     

中国科学家合成高性能荧光RNA实现活细胞RNA成像

据陈显军2019年11月5日[Nature Biotechnology,2019,37(11):1287-1293.]报道,华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室杨弋教授领导的团队利用系列高性能荧光RNA,实现不同种类RNA在动物细胞内活体的荧光标记与无背景成像。迄今为止,在自然界尚未发现天然存在的荧光RNA。目前人工合成的少数几种荧光RNA荧光强度弱,性能不稳定,难以实用。     

基于Monte Carlo荧光分子断层成像前向问题的研究

随着生物和光学技术的成熟，近红外荧光成像得到了飞速发展。荧光分子断层成像是以特定波长的光去激发荧光染料，使其吸收入射光，并发出波长长于入射光的近红外荧光。前向问题是进行光学成像研究的关键环节，可以指导实验以及重建算法。本文提出了一种基于Monte Carlo方法的荧光分子断层成像的光子传输模型，重点研究了激发光激发荧光的过程以及光子在生物体内的传播过程，在已知激发光源、传播介质、荧光物质等参数的条件下，得到荧光光子在CCD探测器上的分布情况，并且分别用理论和实验两种方法对算法的仿真结果进行了验证。     

基于光纤的荧光成像及荧光强度测量系统

基于光纤的荧光成像及荧光强度测量系统由作为激发光源的发光二极管、作为荧光探测器的电荷耦合器件、光纤探头以及用于系统控制和数据处理的计算机软件构成。当光纤探头使用传像光纤时,本系统实现显微荧光成像功能,可以对使用荧光标记的细胞进行离体或者在体观察;当光纤探头使用"1分4"传光光纤时,系统可实现多通道实时荧光强度测量功能,且能够以微创的方式对实验动物体内多个器官进行在体、实时及连续的荧光强度测量,为研究荧光染料在各器官内的代谢情况提供了一种新的工具。     

双光子活体成像技术及其在免疫学中的应用

免疫应答的重要特征是运动性。双光子或多光子荧光显微成像技术以其组织器官穿透性深、光漂白及光毒性低等独特优势,成为活体内研究免疫应答过程的重要工具。本文首先介绍双光子活体成像技术的方法学原理及技术特点,随后简述其引入免疫学的历史。最后,本文重点从技术运用的角度,概括总结了双光子活体成像技术在免疫学研究中的应用。     

建立裸鼠皮下荧光子宫内膜异位症模型

背景：将绿色荧光蛋白标记的裸鼠子宫内膜注射于裸鼠皮下,构建子宫内膜异位症动物模型,操作简便,同时可在一定时间内体外动态观察异位病灶的生长,有利于子宫内膜异位症的深入研究。 目的：探讨构建裸鼠皮下子宫内膜异位症荧光模型的方法。 方法：取裸鼠子宫内膜,采用增强型绿色荧光蛋白腺病毒转染后,注射入6只裸鼠皮下(转染荧光组),将未接受增强型绿色荧光蛋白腺病毒转染的子宫内膜组织块注射到另6只裸鼠腹部皮下(对照组)。于注射后第 5,10,15,20,25,30天在体视荧光显微镜下观察皮下绿色荧光强度,记录荧光标记病灶的持续时间,同时行组织学检测两组异位病灶的情况。 结果与结论：成功构建5个内膜异位症活体荧光裸鼠模型及5个内膜异位症活体非荧光裸鼠模型,平均每只裸鼠形成二三个病灶。利用体视荧光显微镜可通过活体动物的皮肤直接观察到体内病灶生长和发展,荧光面积和强度随时间延长逐渐减弱,可持续观察4 周左右。对照组未检测到绿色荧光病灶。获取病灶组织经苏木精-伊红染色,可观察到典型的子宫内膜腺体和基质结构。结果可见这种改良的裸鼠荧光模型可以动态无损伤量化观察病灶生长和发展情况,有助于内膜异位症新药的开发及其发病机制的研究。