人腹膜间皮细胞的体外培养

目的:建立简便有效的人腹膜间皮细胞(HPMC)的体外培养方法.方法:用0.2%胰蛋白酶-0.02?TANa2消化人大网膜组织,细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养.用形态学、免疫组化(SP法)鉴定细胞.结果:分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状.免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,证实培养的细胞的确是HPMC.结论:胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离HPMC的方法.     

原代人腹膜间皮细胞培养的方法学探讨

目的建立简便有效的获取人腹膜间皮细胞(HPMCs)的方法。方法采用胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-Na2)组织消化法,从人的大网膜中分离出HPMCs;分别从形态学、免疫组化鉴定分离出的细胞。结果分离出的细胞在倒置相差显微镜下早期呈多形性、拉伸状;后期呈多边形、"铺路石状"。细胞表面标志物鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原阴性,证实分离培养的确是HPMCs。结论胰蛋白酶-EDTA组织消化法是一种简便有效的分离HPMCs的方法。     

黄芪注射液对大鼠腹膜细胞凋亡与增殖平衡的作用

目的:探讨中药黄芪注射液对腹膜细胞凋亡和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:在正常 SD 大鼠上建立腹膜透析模型,用含黄芪注射液(200 mg/d,400 mg/d)的生理盐水灌注腹腔,20 ml/次,每日2次;用生理盐水作对照。4周后杀检,取腹膜用 LSAB 试剂盒和 TUNEL 试剂盒检测腹膜细胞凋亡和PCNA 表达。结果:黄芪能显著诱导腹膜间皮细胞凋亡,可刺激 PCNA 表达增加,PCNA 表达量呈浓度依赖性。结论:黄芪注射液加入腹透液中可调节腹膜细胞消长平衡。     

肾康注射液对腹膜透析液诱导的大鼠腹膜组织形态及TNF-α,TGF-β1的影响

目的:研究肾康注射液(Shenkang injection,SKI)对腹膜透析液(peritoneal dialysis solution,PDS)诱导的大鼠腹膜组织形态及肿瘤坏死因子-α(TNF-α),转化生长因子-β1(TGF-β1)影响。方法:50只SD大鼠,随机分为正常组,4.25%PDS组和SKI低、中、高剂量组;除正常组不注射PDS外,其余4组分别ip 4.25%PDS,低、中、高剂量的SKI+4.25%PDS。于注射8周后,水合氯醛麻醉各组大鼠,同时沿腹白线剪开腹壁,量取腹腔内的透出液,ELISA法测定透出液中TNF-α的含量。取壁层腹膜组织,观察腹膜组织形态改变,并用免疫组化法检测TGF-β1的表达。结果:与正常组比较,PDS组大鼠透出液中TNF-α含量和壁层腹膜间皮细胞的TGF-β1表达显著升高(P0.01),且腹膜间皮细胞重度肿胀变性、脱落,间皮下基质明显增生,并可见大量血管增生及炎细胞浸润。与PDS组比较,SKI中、高剂量组的TNF-α含量显著降低(P0.01),SKI各剂量组壁层腹膜间皮细胞TGF-β1的表达明显减少(P0.05),且腹膜结构改变减轻、炎症细胞浸润和基质增生减少。结论:腹膜透析液中加入SKI具有改善PDS诱导腹膜纤维化,其作用机制可能与抑制TNF-α,TGF-β1的增加有关。     

麦冬对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞TNF-α和TGF-β_1表达分泌的影响

目的:考察麦冬对大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)在脂多糖(LPS)作用下肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转移生长因子-β1(TGF-β1)表达分泌的影响。方法:原代培养鉴定RPMC;RT-PCR和ELISA法来分析麦冬对LPS影响下RPMC表达分泌TNF-α和TGF-β1的影响。结果:LPS能够明显增加RPMC表达分泌TNF-α和TGF-β1,而不同浓度的麦冬能降低LPS所致的RPMC的TNF-α和TGF-β1mRNA在转录和翻译水平的上调,这种抑制作用具有剂量依赖性。结论:麦冬能减弱LPS上调RPMC表达炎症因子TNF-α和TGF-β1的作用,进而促进RPMC的增殖修复,控制腹膜炎症,为中药改善腹膜间皮细胞损伤和防治腹膜透析相关腹膜炎及腹膜纤维化提供实验依据。     

黄芪抗腹膜纤维化模型大鼠间皮细胞紧密连接损伤的研究

目的:研究添加黄芪的腹透液对腹膜纤维化大鼠的干预作用,观察黄芪对大鼠腹膜功能和腹膜间皮细胞超微结构的影响.方法:SD大鼠应用含0.75％腺嘌呤饲料喂养建立慢性肾衰竭模型,随机分为对照组、模型组和黄芪组.模型组应用高糖乳酸盐腹透液和脂多糖ip建立腹膜透析相关性腹膜纤维化动物模型,黄芪组应用黄芪注射液(1,2 g·kg-1)干预治疗.4周后采用生化仪检测腹膜超滤功能和腹膜清除率,放射免疫法检测透明质酸(HA)含量;光镜观察腹膜纤维化程度和腹膜间皮细胞结构,透射电镜观察腹膜结构和间皮细胞紧密连接;免疫荧光定量PCR方法检测大鼠封闭蛋白-1(ZO-1)和层粘连蛋白(LN)基因的表达.结果:模型组与对照组相比,腹透液超滤量、尿素氮清除率明显降低(P＜0.05),HA分泌量明显增加(P＜0.01),光镜和电镜表现为腹膜间皮细胞脱落,间皮下基质明显增厚,炎性细胞浸润,纤维素样物质沉积,相邻间皮细胞间紧密连接消失;RT-PCR检测也显示LN表达明显增加,ZO-1表达明显减少(P＜0.05).黄芪组与模型组比较,腹透液超滤量、尿素氮清除率明显增加(P＜0.05),光镜和电镜也显示间皮细胞结构基本完整,紧密连接损伤较轻;而HA分泌量无明显差异,对LN和ZO-1表达也无明显影响.结论:高糖透析液和炎症因子是导致腹膜纤维化的主要因素,可破坏细胞间的紧密连接,抑制ZO-1蛋白的表达.黄芪对于腹膜间皮细胞的结构和功能具有一定的保护作用,但对ZO-1表达的影响不显著.     

小鼠胸膜间皮细胞培养方法的建立及其意义

目的:分离出小鼠的胸膜间皮细胞组织,并对其进行原代培养,以观察胸膜间皮细胞的生长情况。方法:采用剪切组织块法建立小鼠胸膜间皮细胞培养体系,获取小鼠胸膜间皮细胞;用光镜与免疫组化染色法进行细胞鉴定。结果:含血清的培养基能培养出小鼠的胸膜间皮细胞,但剪切法成纤维细胞污染较少,且由于它培养后表型丧失快,基本不传代,并且培养难度较大,不易获得较高纯度胸膜间皮细胞;可直接取小鼠胸膜间皮组织进行抗角蛋白染色,角蛋白染色阳性纯度达几乎100%。结论:剪切组织块法用含血清的培养基即可培养出小鼠的胸膜间皮细胞,是低成本、简便易行的研究中医藏象理论模型鼠胸膜间皮细胞的培养体系。     

灯盏花素对腹膜透析相关腹膜间皮细胞VEGF及TGF-β1的影响

目的:探讨灯盏花素对腹膜透析液诱导的体外培养的人腹膜间皮细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)及转化生长因子β1(TGF-β1)分泌的影响。方法:体外培养人腹膜间皮细胞,随机分对照组、PDS组、DA组(灯盏花素终浓度为5μmol/L)、DB组(灯盏花素终浓度为10μmol/L)、DC组(灯盏花素终浓度为20μmol/L)5组对照观察。培养48 h后检测各组上清液中VEGF及TGF-β1的含量并进行比较。结果:腹膜间皮细胞在PDS诱导下,VEGF及TGF-β1分泌显著增加(P<0.01);与PDS组比较,经灯盏花素干预后的VEGF参数DB、DC组及TGF-β1参数DA、DB、DC组显著下降(P<0.05,P<0.01)。结论:灯盏花素可以抑制腹膜透析液诱导的体外培养的人腹膜间皮细胞VEGF及TGF-β1的分泌。     

健脾益气方调控间隙连接蛋白43防治PD大鼠腹膜损伤的作用机制研究

目的:研究健脾益气方通过调控间隙连接蛋白(Cx) 43干预腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞转分化的作用机制。方法:将75只大鼠随机分为5组,即空白组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组,除空白组大鼠外,其余各组均采用5/6肾切除联合腹腔注射4. 25%腹透液复制慢性肾衰竭腹膜纤维化大鼠模型。造模成功后,中药高、低剂量组给予健脾益气方,西药组给予阿托伐他汀钙,模型组给予0. 9%氯化钠注射液,空白组不做任何处理。每天灌胃1次,连续4周。干预后光镜观察各组大鼠腹膜结构变化,测量腹膜致密层厚度;免疫组化法及蛋白质印迹法检测Cx43、蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKt/m TOR)通路和腹膜间皮细胞转分化(EMT)标志蛋白表达。结果:各组大鼠腹膜厚度及Cx43、p AKt、pm TOR、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)阳性面积比,空白组与模型组比较,中药高、低剂量组及西药组与模型组比较,中药高剂量组与西药组、中药低剂量组比较,差异均有统计学意义(P 0. 05)。各组大鼠腹膜组织Cx43、p AKt、pmTOR、α-SMA、E-cadherin蛋白表达,空白组与模型组比较,中药高剂量组与西药组比较,差异均有统计学意义(P 0. 05)。结论:健脾益气方可能通过调控Cx43表达,干预Akt/m TOR信号通路介导的腹膜间皮细胞EMT进程,从而发挥保护腹膜间皮细胞、防治腹膜损伤的作用。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的:探索纯度较高、相对经济简便的大鼠脑微血管内皮细胞分离和原代培养的方法。方法:取1～10 d SD大鼠脑皮质经胰蛋白酶消化后,通过不同孔径的筛网过滤,再用胶原酶2次消化获得的微血管内皮细胞进行培养,采用相差显微镜形态学观察及Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定。结果:1～2 d细胞呈区域性单层贴壁生长,7～9 d呈典型的铺路卵石样征象,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测内皮细胞表达阳性,可见细胞的胞浆及核周呈棕黄色,胞核呈阴性,阳性细胞占绝大部分。结论:采用2次消化、2次过滤技术可以成功分离培养出较理想的大鼠脑微血管内皮细胞。     

三七总皂苷对腹膜间皮细胞表达MCP-1的影响

目的:研究三七总皂苷对腹膜间皮细胞表达单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的影响。方法:原代培养腹膜间皮细胞,研究不同浓度三七总皂苷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的腹膜间皮细胞表达MCP-1的影响,研究三七总皂苷作用不同时间对脂多糖诱导的腹膜间皮细胞表达MCP-1的影响。结果:不同浓度三七总皂苷可以抑制脂多糖诱导的腹膜间皮细胞MCP-1mRNA和蛋白表达,这种作用随三七总皂苷浓度的增加而增强;三七总皂苷作用不同时间可抑制脂多糖诱导的腹膜间皮细胞MCP-1mRNA和蛋白表达,这种作用随三七总皂苷作用时间的延长而增强。结论:三七总皂苷可抑制脂多糖诱导的腹膜间皮细胞MCP-1表达,呈浓度和时间依赖性。     

灯盏花素对尿毒症大鼠腹膜透析效能及腹膜结构的影响

目的:观察灯盏花素对于尿毒症大鼠腹膜透析效能及腹膜结构的影响。方法:采用随机分组对照方法,对于尿毒症大鼠腹膜透析模型进行长期腹膜透析治疗,采用腹透液加入灯盏花素进行干预,对比用药组与对照组D/P肌酐和超滤量的变化。结果:高浓度组与低浓度组间D/P肌酐、超滤量比较无显著差异(P=0.855);高浓度组、低浓度组的D/P肌酐、超滤量均较对照1组显著升高(P<0.05),但低于对照1组(P<0.001)。组织病理学结果:间皮细胞完整性破坏、间皮下基质积聚、炎性细胞的浸润和毛细血管的增生等方面,程度上由高到低依次为对照1组、低浓度组、高浓度组、对照2组。结论:灯盏花素能够对腹膜间皮细胞具有保护作用,且能够提高腹膜透析效能。     

扶肾方对大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响及机制探讨

目的:观察扶肾方对腹膜透析大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响及可能机制。方法:采用SD大鼠切除5/6肾脏+1.5%百特腹透液的方法复制大鼠腹膜纤维化模型。扶肾方干预6周后,检测血清学指标肌酐和尿素氮的含量;HE观察腹膜形态的变化;RT-PCR法检测各组腹膜间充质标志物Vimentin和α-SMA的表达;ELASA法检测TGF-βRI和TGF-βRII含量的变化。结果:扶肾方干预后,各组血清肌酐及尿素氮均呈现下降趋势,尤其以高剂量组最为明显(P0.05);扶肾方组腹膜间皮细胞变性、脱落,炎症细胞浸润以及血管新生现象明显减少;RT-PCR检测结果显示,与模型组相比,Vimentin各组表达均有所下降,但以中剂量组下调最为明显(P0.05);腹膜纤维化相关因子TGF-βRI和TGF-βRII检测结果中,TGF-βRI的表达呈上升趋势,同模型组相比有显著性差异(P0.01,P0.05),TGF-βRII的表达则呈下降趋势,差异有统计学意义(P0.05)。结论:扶肾方能够有效抑制腹膜间皮细胞转分化,改善腹膜纤维化,可能与调节TGF-βRI和TGF-βRII的表达有关。     

三七总皂苷对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的作用

目的探讨三七总皂苷(PNS)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分化为心肌样细胞。方法采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面标志,用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化,采用相差显微镜、免疫组化及RT-PCR鉴定心肌细胞。结果大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性,CD34阴性;经PNS体外诱导后细胞形态发生变化,其细胞免疫组化呈结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnI)阳性;RT-PCR显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。结论大鼠MSCs体外在PNS诱导下可分化为心肌样细胞,为应用MSCs治疗心肌损伤提供了动物实验方法。     

雄黄对NB4和MR2细胞组织因子表达的影响

目的 :探讨雄黄对NB4细胞 (维甲酸敏感的急性早幼粒细胞白血病细胞株 )和MR2 细胞 (维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞株 )促凝活性 (PCA)和组织因子 (TF)表达的影响。方法 :用 300μg·L^-1雄黄与NB₄和MR₂ 细胞共同孵育 ,分别用复钙时间、ELISA方法、半定量RT PCR检测未处理及雄黄处理6 ,12 ,24 ,48,72h后NB₄和MR₂ 细胞的促凝活性、TF抗原表达及TFmRNA转录的变化。同时检测未处理的HL 6 0 ,K562细胞的PCA ,TF抗原表达作为对照。结果 :NB₄和MR₂细胞的PCA和TF抗原水平明显高于HL 60和K562细胞。雄黄呈时间依赖方式下调NB₄和MR₂ 细胞的促凝活性 ,TF抗原的表达及TFmRNA的转录。结论 :下调NB₄和MR₂ 细胞TF的表达并降低其PCA可能是雄黄改善APL患者弥散性血管内凝血 (DIC)早期出血症状的主要机制之一。     

健脾益气方改善腹膜透析大鼠微炎症状态诱导腹膜损伤的作用及机制研究

目的:研究健脾益气方对腹膜透析大鼠内质网应激通路IRE1α-XBP1和微炎症状态因子的调控作用,探讨其防治微炎症状态诱导腹膜损伤的作用及可能机制。方法:SD雄性大鼠75只,随机分5组,每组15只,即健脾益气方高剂量组、健脾益气方低剂量组、奥美沙坦酯组、空白组、模型组,除空白组外,其余各组大鼠采用5/6肾切除联合腹腔注射4. 25%腹透液复制腹膜透析大鼠模型,模型成功后,开始给药,1次/d,连用30 d。光镜观察腹膜组织结构,测量腹膜致密层厚度。酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清微炎症标志因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α);免疫组化法及Western blotting法检测内质网应激通路IRE1α-XBP1标志蛋白GRP78、p IRE1α、XBP1s和腹膜间皮细胞损伤标志分子α-SMA及E-cadherin表达。结果:健脾益气方高剂量组、健脾益气方低剂量组、奥美沙坦酯组、模型组大鼠腹膜致密层厚度,血清IL-6、TNF-α炎症因子含量,GRP78、p IRE1α、XBP1s和α-SMA水平均高于正常组(P 0. 05),E-cadherin水平则低于正常组(P 0. 05);治疗后与模型组比较,健脾益气方高剂量组、健脾益气方低剂量组和奥美沙坦酯组上述指标水平显著降低(P 0. 05),E-cadherin水平则显著升高(P 0. 05);健脾益气方高剂量组优于奥美沙坦酯组(P 0. 05)。结论:健脾益气方能有效防治PD微炎症状态诱导的PMC损伤,其机制可能是通过干预腹膜间皮细胞内质网应激IRE1α-XBP1通路,激活其适应性保护作用,以减轻微炎症状态导致腹膜间皮细胞EMT改变。其临床应用效果有待进一步研究。     

大鼠血管外膜成纤维细胞的原代培养及生物学行为研究

目的:建立大鼠血管外膜成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的方法,并对其生物学特征进行观察。方法:通过组织块贴壁法,以含20%胎牛血清的DMEM诱导细胞生长,0.25%的胰酶消化细胞传代后用含10%胎牛血清的DMEM在37℃,5%CO₂,饱和湿度下培养。倒置显微镜下观察成纤维细胞形态,进行细胞中间丝蛋白的免疫化学鉴定,并绘制细胞生长曲线。结果:成纤维细胞能够迅速从组织块长出并增殖,波形蛋白免疫细胞化学染色为阳性,结蛋白及第Ⅷ因子染色为阴性,细胞在第(2～4)天进入指数生长期。结论:该方法所获得的血管外膜成纤维细胞可在体外稳定培养,为在细胞水平研究血管再狭窄机制提供了充足可靠的靶细胞模型。     

热毒净对鼻咽癌细胞株CNE2抑制作用的研究

目的:观察热毒净对表达EB病毒抗原的CNE₂细胞致瘤的影响及其细胞毒作用。方法:用MTT法测定热毒净对CNE₂细胞的细胞毒作用,抑瘤实验检测热毒净对CNE₂细胞致瘤的影响。结果:MTT法显示在低浓度下,热毒净对体外培养的CNE₂细胞生长没有明显的抑制作用,但在高浓度下,对细胞生长有抑制作用。热毒净在无细胞毒的浓度下,能抑制CNE₂细胞在SCID小鼠体内所致肿瘤的生长。浓度越高,热毒净对肿瘤生长的影响越明显。结论:热毒净能抑制CNE₂细胞在SCID小鼠体内的致瘤作用。     

半夏泻心汤含药血清对胃癌细胞外泌体诱导的腹膜间皮细胞FN1、LAMC1表达及胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附、侵袭的影响

目的 观察半夏泻心汤含药血清对胃癌细胞来源外泌体诱导的腹膜间皮细胞纤维连接蛋白1(FN1)和层粘连蛋白γ1(LAMC1)表达及胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附、侵袭的影响，探讨其抑制胃癌腹膜转移的作用机制。方法 制备半夏泻心汤含药血清，提取人胃癌细胞NCI-N87外泌体，采用透射电镜观察及Western blot进行鉴定。将人腹膜间皮细胞HMrSV5分为正常对照组、模型组、5-氟尿嘧啶（5-FU）组和半夏泻心汤低、中、高剂量组，每组3个复孔，以NCI-N87细胞外泌体诱导HMrSV5细胞，并分别用10%含药血清培养，ELISA检测HMrSV5细胞上清液FN1和LAMC1含量，PCR检测HMrSV5细胞FN1和LAMC1mRNA表达，荧光酶标仪检测NCI-N87细胞与HMrSV5细胞黏附情况，Transwell小室检测NCI-N87细胞向HMrSV5细胞侵袭情况。结果 透射电镜观察NCI-N87细胞外泌体呈椭圆或碟状囊泡结构，粒径介于40～80 nm，外泌体标志蛋白CD9、CD63高表达，钙网蛋白低表达。与正常对照组比较，模型组HMrSV5细胞上清液FN1和LAMC1含量明显增加，HMrSV5...     

一种成年SD大鼠背根节神经元分离与培养新方法的建立

目的:建立成年SD大鼠背根神经节神经元的分离和培养的方法,并探索胶原酶的最佳消化时间。方法:取成年Sprague-Dawley(SD)大鼠的背根神经节(Dorsal Root Ganglion,DRG),经0.5%的胶原酶Ⅰ和0.05%胰酶消化后,接种到多聚赖氨酸包被的细胞培养板中;4 d后传代并用差速贴壁法纯化神经元细胞;采用神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific Enolase,NSE)免疫组化试剂盒进行鉴定,并计算细胞纯度;分别用胶原酶作用1h、24 h和48 h来探索胶原酶消化的最佳时间。结果:培养的DRGs生长状态良好,传代一次后杂细胞多数被去除,神经元的纯度可达到(94.28±1.87)%,贴壁的DRG神经元可存活2至3周。结论:成功建立成年SD大鼠DRG神经元原代培养体系,该体系可获得生长状态良好、纯度较高的DRG神经元细胞。