丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

背景:随着组织工程的兴起,软骨损伤的修复可能性显著地提高,但单一的支架材料均不能符合理想支架,有一定的局限性.目的:观察骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石构建组织工程化软骨的可行性.方法:体外分离培养骨髓间充质干细胞,并定向诱导成软骨细胞,与丝素蛋白/羟基磷灰石复合培养,构建膝关节胫骨平台全层关节软骨缺损.54只大白兔单侧膝关节全层软骨缺损模型后随机抽签法分为3组,复合组植入细胞-丝素蛋白/羟基磷灰石复合物;材料组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石,对照组不行任何植入.植入后8,12周CT检查及组织学检查观察软骨缺损修复情况.结果与结论:植入后8周,复合组关节面不平整,关节间隙增大,形成新生类软骨细胞,基质丰富.材料组关节面塌陷,软骨细胞少量增殖.植入后12周,复合组关节面平整,关节间隙如常.大量软骨细胞出现,与周边软骨色泽一样,支架材料完全降解.材料组关节面不平整,软骨细胞不完全充填,支架材料部分降解.对照组未见修复.提示用骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损,显示了丝素蛋白/羟基磷灰石材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性.     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

背景:最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性.目的:验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况.方法:贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况.培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量.结果与结论:发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞.骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养.结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.     

丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

背景：随着组织工程的兴起,软骨损伤的修复可能性显著地提高,但单一的支架材料均不能符合理想支架,有一定的局限性。目的：观察骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石构建组织工程化软骨的可行性。方法：体外分离培养骨髓间充质干细胞,并定向诱导成软骨细胞,与丝素蛋白/羟基磷灰石复合培养,构建膝关节胫骨平台全层关节软骨缺损。54只大白兔单侧膝关节全层软骨缺损模型后随机抽签法分为3组,复合组植入细胞-丝素蛋白/羟基磷灰石复合物;材料组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石,对照组不行任何植入。植入后8,12周CT检查及组织学检查观察软骨缺损修复情况。结果与结论：植入后8周,复合组关节面不平整,关节间隙增大,形成新生类软骨细胞,基质丰富。材料组关节面塌陷,软骨细胞少量增殖。植入后12周,复合组关节面平整,关节间隙如常。大量软骨细胞出现,与周边软骨色泽一样,支架材料完全降解。材料组关节面不平整,软骨细胞不完全充填,支架材料部分降解。对照组未见修复。提示用骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损,显示了丝素蛋白/羟基磷灰石材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性。     

58S生物玻璃／壳聚糖复合多孔支架材料的制备

背景:在前期研究的基础上用壳聚糖溶液与纯的58S生物玻璃支架进行复合,通过体外测试考察其生物活性,以确定是否符合组织工程对支架材料的要求.目的:观察58S生物玻璃/壳聚糖复合多孔支架的生物矿化特性及其与鼠骨髓问充质干细胞之间的体外相容性.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-03/10在华南理工大学材料科学与上程学院生物材料研究所完成.材料:选用58S生物活性玻璃粉体为原料,利用预先处理过的聚氨酯泡沫作为模板,通过浸渍法制备58S生物玻璃支架基体,与壳聚糖复合后制成生物玻璃,壳聚糖复合支架.方法:①将试样放置于37℃恒温静态的100mL模拟生理溶液中,分别浸泡1,3,7,15d后取出样品,测试备用·②将第6代的小鼠骨髓间充质十细胞悬液以2×105/每个材料的密度接种到12孔培养板中的支架材料上复合培养.主要观察指标:采用X射线衍射分析和红外光谱分析方法对支架矿化不同时间表面生成的矿物进行分析和表征;利用扫描电子显微镜观察支架表面矿物生成情况和小鼠骨髓间充质十细胞在多孔支架材料上的生长情况.结果:①X射线衍射分析结果碌示支架在模拟生理溶液中矿化7d后即出现标志羟基磷灰石形成的弱衍射峰,矿化15d后这些衍射峰变得更强.说明材料表面形成了低结晶度的羟基磷灰石.②红外光谱分析测试结果显示支架在矿化7 d后即出现了标志羟基磷灰石形成的特征蜂.③扫描电镜观察支架表面在矿化1 d后有颗牲状的矿物生成,矿化15 d后所形成的矿物成绒毛状,几乎覆盖整个支架表面.④小鼠骨髓间充质干细胞在支架材料上培养5 d后黏附生长良好,进一步表明此支架材料具有较高的生物矿化特性和细胞相容性.结论:制备的58S/壳聚糖复合生物玻璃多孔支架具有较高的生物活性、与鼠骨髓间充质干细胞相容性良好.     

成骨诱导人脐带间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架材料的生物相容性

背景:纳米羟基磷灰石/聚酰胺66材料有利于成骨细胞的长入和新生骨的形成、且抗弯强度、抗压强度等各项参数与正常骨组织的力学性能相接近,能满足实验动物硬组织修复的要求.目的:分析成骨诱导后人脐带间充质干细胞与纳米羟基磷灰石/聚酰胺66复合支架的生物相容性.方法:体外培养人脐带间充质干细胞,纯化增殖,成骨诱导.取成骨诱导后的第3代人脐带间充质干细胞接种于纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架材料上,观察细胞的生长、增殖情况及材料细胞毒性.结果与结论:成骨诱导后人脐带间充质干细胞在复合支架上生长分化良好,增殖活性不受材料影响.成骨诱导14 d内,可见碱性磷酸酶活性随着培养时间延长而逐渐增高.MTT法检测细胞无毒性.扫描电镜观察,1 d后可见细胞在支架表面附着生长;7 d后可见细胞在材料上生长良好,材料空隙有大量充填.说明纳米羟基磷灰石/聚酰胺66支架可作为骨组织工程中人脐带间充质干细胞的细胞载体,具有良好的生物相容性,能满足骨组织工程的需要.     

藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景:传统的体外诱导干细胞向软骨细胞定向分化的方法有高密度细胞团块培养和平面培养.细胞团块诱导方式培养过程易损害细胞活性,而平面培养获得的细胞数量有限.目的:观察藻酸钠微球中骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化潜力,及其在壳聚糖复合支架上的生长情况.设计、时间及地点:对比观察实验.于2007-03/10在武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室完成.材料:SPF级1月龄雄性Wistar大鼠7只.壳聚糖复合支架材料由武汉大学资源与环境学院研制.藻酸钠盐、转化生长因子β3、胰岛素样生长因子I均为Sigma公司产品.方法:取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓,体外扩增培养骨髓间充质干细胞.实验组用转化生长因子β3和胰岛素样生长因子I联合定向诱导藻酸钠微球包被的骨髓间充质干细胞3周,对照组培养条件中无转化生长因子β3和胰岛素样生长因子I.诱导3周后,免疫组织化学方法和反转录-聚合酶链反应法检测ii型胶原蛋白和aggrecan的表达.从微球中释放诱导的软骨细胞并接种于壳聚糖复合支架.扫描电镜观察其生长情况.主要观察指标:软骨特异性的Ⅱ型胶原、aggrecan的表达以及软骨细胞的三维形态.结果:实验组藻酸钠微球中的骨髓间充质干细胞表达的Il型胶原和aggrecan明显高于对照组(P<0.05),与原代软骨细胞比较差异无显著性意义(P>0.05).壳聚糖复合支架支持分化软骨细胞的贴壁、伸展、增殖和迁徙,并呈典型的软骨细胞生长形态.结论:转化生长因子β3和胰岛素样生长因子I能诱导藻酸钠微球中的骨髓间充质干细胞定向分化成软骨细胞,并与壳聚糖复合支架表现出良好的组织相容性.     

仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原的制备及其细胞相容性

背景:目前骨组织工程常用的支架材料主要有无机材料、有机高分子材料及天然衍生材料等,上述材料各有优缺点,为了充分发挥各类材料的优势,弥补其不足,目前多采用联合材料制备复合支架。目的:制备新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原,并观察其对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及分化的影响。方法:制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合支架材料,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;采用真空吸附法将骨形态发生蛋白7多肽与支架材料复合,高效液相色谱仪检测骨形态发生蛋白7多肽在体外的释放规律;将骨髓间充质干细胞接种到复合骨形态发生蛋白7多肽的仿生支架材料上,以未复合多肽的支架材料作为对照,检测支架材料表面细胞增殖、黏附率、生长形态及碱性磷酸酶活性。结果与结论:壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原支架材料呈多孔状,孔径10~100μm;骨形态发生蛋白7多肽可以从支架材料中缓慢释出;在复合多肽的仿生支架材料表面,骨髓间充质干细胞的黏附及向成骨细胞方向分化能力均明显强于对照组(P<0.05),而增殖能力与对照组差异无显著性意义(P>0.05)。说明新型仿生支架材料骨形态发生蛋白7多肽/壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原是一种理想的骨组织工程支架材料,具有良好的细胞相容性。     

兔骨髓间充质干细胞与异体脱细胞耳软骨支架的体外复合

背景：耳软骨作为脱细胞基质可选择的支架,进行脱细胞处理可去除了软骨细胞的抗原性,从而与种子细胞具有良好的相容性。目的：体外提取、培养兔骨髓基质干细胞,并与异体脱细胞耳软骨支架复合,观察其生物相容性。方法：提取兔骨髓间充质干细胞行体外培养,诱导为软骨细胞,以胰蛋白酶-曲拉通联合法获得脱细胞软骨支架,将两者于体外复合,10d后复合支架固定行组织学染色及扫描电镜观察。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞体外诱导14d可形成软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学示胞浆呈棕黄色;兔耳软骨脱细胞基质呈乳白色,组织学染色及扫描电镜观察示经脱细胞后支架孔隙均匀,结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及胶原成分。其孔径长度（33.70±4.33）μm,孔隙率（65.23±7.35）%。复合支架组织学染色及扫描电镜示两者黏附良好,并伴有多量基质分泌。说明兔骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞与异体脱细胞耳软骨有良好的生物相容性。     

兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架

背景:软骨组织工程的核心是利用少量的细胞经体外培养、扩增后,在一定环境下附着在三维多孔支架上,再将细胞/支架复合体移植到体内形成新的组织.目的:拟构建兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体,探讨该支架作为软骨组织工程支架的可行性.设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2008-03/2009-02在武警医学院生物化学教研室完成.材料:日本大耳白兔6只用于分离培养骨髓间充质干细胞.医用壳聚糖粉末为山东奥康生物科技有限公司产品.Ⅰ型胶原为Sigma公司产品.方法:取3%的壳聚糖和2%的胶原混合的醋酸溶液,倒入72孔板内,-20℃预冷冻10 h,冻干机冷冻抽干24 h制作成壳聚糖-胶原支架.取第3代兔骨髓间充质干细胞,以1×109L-1密度接种于支架内,构建细胞/支架复合体.主要观察指标:傅里叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定支架的理化性质,观察三维培养后细胞在支架上的生长情况.结果:壳聚糖-胶原支架孔径为160～380 μm,平均为270 μm,孔相通性好,支架孔隙率为(86.00±5.12)%.傅里叶红外光谱仪测定数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰,未发现有聚乙二醇峰.细胞/支架共培养24,48,72 h后,骨髓间充质干细胞可渗入支架多孔结构内,并黏附在支架上成簇生长,部分细胞已与支架融合.结论:壳聚糖-胶原支架基本符合软骨组织工程支架要求,能够作为种子细胞的承载体.     

纳米壳聚糖-胶原纤维支架的生物相容性

背景:新型仿生纳米壳聚糖-胶原支架在纳米水平上与细胞外基质结构相似,其是否可促进骨髓间充质干细胞的黏附及生长,并显示良好的相容性?目的:评价新型纳米壳聚糖-胶原支架与SD大鼠骨髓基质干细胞的体外相容性.设计:单一样本观察.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/2007-07在暨南大学附属第一医院实验中心完成.选取10只4周龄雌性SD大鼠,SPF级,体质量200 g,由广东省实验动物中心提供(许可证号为SCXK(粤)2003-0002).实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.纳米壳聚糖-胶原纤维支架由理工学院生物材料研究室提供.方法:①分离培养SD大鼠骨髓基质干细胞,流式细胞分析法对细胞表面抗原进行检测.②聚电解质共凝聚技术制作纳米壳聚糖-胶原纤维支架.③取生长良好的P3代,与纳米壳聚糖-胶原纤维支架体外联合诱导培养,以单纯纳米壳聚糖支架材料为对照,通过细胞贴壁率、生长曲线、细胞活力及周期、扫描电镜观察综合评价材料与细胞的相容性. 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞分离培养后进行流式细胞表面抗原标志鉴定.②纳米材料及细胞复合2,4,8 d后扫描电镜观察细胞与材料相容情况.③细胞对材料黏附率的测定.④细胞与材料复合5 d检测细胞周期及活力.结果:①细胞表面抗原标志检测结果:CD29表达为90.86%,CD106表达为73.38%,CD44表达为82.61%,CD34表达为0.76%,CD45表达为0.60%.②细胞与材料相容情况:扫描电镜可见纳米壳聚糖-胶原纤维支架为多孔的三维立体结构,材料内部形成大小不一的大孔和互连的小孔,彼此相互交通.应用质量法测得的孔隙率为85%～90%,孔径为50～300 μm,平均150 μm.骨髓基质干细胞复合到纳米壳聚糖-胶原纤维支架后2 d,细胞呈球形散在分布;4 d后细胞呈梭形,延展爬行且有伪足与材料表面锚靠;8 d时细胞增殖,相互间融合,并有大量的细胞外基质分泌,大部分材料颗粒被覆盖.③细胞对材料黏附率:细胞-支架复合物共培养2及6 h,骨髓基质干细胞在纳米壳聚糖-胶原纤维支架的黏附率均高于单纯纳米壳聚糖支架.④纳米壳聚糖-胶原纤维支架与单纯纳米壳聚糖支架的细胞、细胞周期特点比较:纳米壳聚糖-胶原纤维支架细胞活力为96.67%,细胞周期G0-G1为90.81%,G2-M为0.52%,S为8.66%,G2/G1为1.81.单纯纳米壳聚糖支架细胞活力为95.27%,细胞周期G0-G1为87.14%,G2-M为9.69%,S为4.16%,G2/G1为1.80.结论:纳米壳聚糖-胶原支架与骨髓基质干细胞有良好的组织相容性,可用来做组织工程生物材料.