牙龈卟啉单胞菌在消化系统肿瘤中的作用及机制研究

越来越多的证据表明牙周疾病是导致消化系统肿瘤的一个重要危险因素,而牙龈卟啉单胞菌(Pg)是引起牙周疾病及慢性牙周炎的关键病原体。大量研究表明,牙龈卟啉单胞菌除在口腔中具有局部作用外,还可能引发其他器官肿瘤,该细菌可能与胃和结肠的癌前病变、食管鳞状细胞癌、头颈部肿瘤和胰腺癌存在密切关系。本文重点总结了牙龈卟啉单胞菌和消化系统肿瘤之间的关系及相互作用机制的最新研究进展。     

问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定

目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。     

16S rDNA多重PCR检测牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌和齿垢密螺旋体及混合感染与慢性牙周炎病变程度关系(英文)

目的 建立多重16S rDNA PCR方法用以同时检测慢性牙周炎(CP)临床标本中牙龈卟啉单胞菌(Pg)、伴放线放线杆菌(Aa)和齿垢密螺旋体(Td),并了解不同感染情况与慢性牙周炎严重程度的关系。方法 采集152例CP患者牙周袋标本,并按Hugoson的方法将其分为轻、中和重度三类,另采集30例牙周健康者龈沟标本作为正常对照。上述临床标本置于200μl裂解缓冲液中,100℃冰浴10min后取10μl上清液直接作为PCR的模板。采用常规酚-氯仿法提取Pg ATCC33277株、Aa Y4株、Td FM株和E.coli DH5α株的DNA分别作为PCR的阳性和阴性对照。采用Pg、Aa和Td 16S rDNA特异性引物,建立多重PCR检测上述标本。3例Pg、Aa和TdPCR结果均阳性患者牙周袋标本目的扩增片段T-A克隆后测序。采用X2检验分析Pg、Aa和/或Td感染率与牙周炎严重程度之间的关系。结果 所建立的多重16S rDNA PCR最低可检出10个Pg、20个Aa和20个Td细胞。Pg、Aa和Td 16S rDNA扩增片段测序结果与已报道的相应序列比较,相似性分别高达99.45％、97.08％和96.59％。30例牙周健康者龈沟标本中,仅有1例(3.3％)Pg、2例(6.7％)Aa的16S rDNA扩增结果阳性,其余标本均阴性。152例CP患者牙周袋标本中,147例(96。7％)检出Pg、Aa和/或Td的16S rDNA,5例(3.3％)扩增结果均阴性。Pg的PCR检测阳性     

弓形虫表面抗原P35基因片段的表达纯化和抗原性分析

目的制备具有免疫活性的弓形虫表面抗原P35基因片段的重组蛋白,并对其抗原性进行分析。方法根据弓形虫RH株表面抗原P35的cDNA序列设计一对引物,利用PCR技术从RH株弓形虫基因组中扩增出P35的基因片段,将其克隆到T载体中,并通过基因测序加以证实;将其亚克隆至原核表达载体pET KDO中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。采用免疫印迹法对表达产物进行抗原性分析。结果从弓形虫RH株基因组中成功扩增到P35目的基因,该基因在原核系统中经诱导表达出分子量约42 000 Da大小的融合蛋白,经免疫印迹实验表明,表达产物具有良好的抗原性,经亲和层析纯化后得到了重组蛋白。结论运用基因工程技术得到了高纯度并具有良好抗原性的弓形虫重组P35融合蛋白。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛融合抗原基因果实特异表达载体的构建及意义

目的构建含牙龈卟啉单胞菌菌毛融合抗原基因的番茄果实特异表达载体,并提高抗原基因的表达量和免疫原性,为其在番茄果实内表达和研制有效的转基因植物牙周炎疫苗奠定基础。方法通过PCR获得番茄果实特异表达启动子E8的核心序列片段（约1．11kb）,同时合成通过柔性接头连接的霍乱毒素B亚基（Cholera Toxin B Subunit,CT8）和牙龈卟啉单胞菌菌毛FimA（266-337）（约600bp）序列的基因片段,利用重叠区扩增基因拼接法将两基因片段连接,得到重组片段E8．CTB．FimA（266-337）,双酶切E8-CTB-FimA（266-337）片段和植物表达载体pB1121,酶切产物连接后,获得重组载体pBIE8-CTB-FimA（266-337）,利用酶切方法和测序方法对pBIE8-CTB-FimA（266-337）进行鉴定。结果基因测序及酶切结果表明特异表达载体已成功构建。结论本研究成功构建了含牙龈卟啉单胞菌菌毛融合抗原基因的番茄果实特异表达载体;该载体可用于转基因植物牙周炎疫苗的研制。     

牙龈卟啉单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察

目的 研究牙龈卟啉单胞菌及其可溶性毒力因子对人多形核白细胞的影响,探讨其导致慢性牙周炎发生的作用机制.方法 采集健康中老年人外周血,利用透射电镜观察多形核白细胞培养组(对照组)与牙龈卟啉单胞菌超声粉碎滤液共同培养组(实验组)多形核白细胞脱颗粒现象.结果 实验组多形核白细胞发生明显的形态学变化,而对照组细胞无明显变化;实验组脱颗粒白细胞百分数较对照组显著增多(P＜0.001).结论 牙龈卟啉单胞菌可诱导多形核白细胞中颗粒向细胞周边移动并脱出,从而降低宿主的免疫能力,在慢性牙周炎发生中具有重要作用.     

二重PCR检测龈下菌斑中齿垢密螺旋体感染及其与牙周炎病变程度的关系

目的 建立龈下菌斑标本中齿垢密螺旋体二重PCR临床快速检测方法,了解齿垢密螺旋体感染与慢性牙周炎病变程度之间的关系。方法 采取158例不同病变程度的慢性牙周炎龈下菌斑标本,用终浓度为1％的Triton X-100 100℃水浴10 min处理标本以制备DNA模板。采用PCR检测标本中齿垢密螺旋体16S rDNA和特征性外膜蛋白基因tdpA。采用卡方检验分析齿垢密螺旋体感染与慢性牙周炎(CP)不同病变程度的关系。结果 85.4％(135/158)标本16S rDNA阳性,77.2％(122/158)tdpA阳性,14.6％(23/158)两者均阴性,未发现tdpA阳性而16S rDNA阴性的标本。重度CP龈下菌斑标本16S rDNA和tdpA检出率均高于中度cP(r2=4.03,5.71;P<0.05),中度CP龈下菌斑标本16S rDNA和tdpA检出率均明显高于轻度(X2=9.32,16.06,P<0.01)。结论 所建立的二重PCR可用于牙周炎龈下标本中齿垢密螺旋体的临床快速诊断,齿垢密螺旋体感染与牙周病变程度密切相关。     

阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因cap2037的克隆与表达

目的对阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因的克隆与原核表达。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TvV—T1序列设计一对引物，经RT—PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析，再将其克隆至表达载体pET28a。并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果目的基因片段长度为2037bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的同源性最高为82．9％，构建原核表达载体pET—Cap2037；IPTG诱导后，SDS—PAGE显示表达产物的大小约75kDa。结论成功克隆出阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因序列，与TVV—T1株序列有82．9％的同源性，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，75kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达。     

2型糖尿病伴牙周病患者牙周干预后龈下菌斑中牙周致病菌的比较分析

［摘要］　目的　观察2型糖尿病伴牙周病患者牙周干预后临床指标的变化和龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌（Pg）的检出量变化,初步探讨龈下微生物的检出量与牙周干预疗效之间的关系。方法　根据随机数字表将确诊为2型糖尿病并伴有牙周病的患者分为实验组和对照组,记录牙周指数。实验组进行牙周干预并取龈下菌斑检测,对照组仅取龈下菌斑进行检测。6个月后复查。观察临床指标和牙龈卟啉单胞菌检出量的变化。结果　基线时两组的临床指标和Pg检出量比较差异均无统计学意义（P均>0.05）,6个月时,实验组临床指标值较对照组显著降低（P<0.01）,Pg检出量降低,但与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。经过牙周干预治疗后,实验组出血指数（SBI）和附着丧失（AL）值均减小,SBI和AL值变化差异均具有统计学意义（P<0.05）;而对照组基线和6个月的临床指标值变化差异均无统计学意义。两组Pg的PCR定量检测结果在基线和6个月时变化差异均无统计学意义（P>0.05）。结论　牙周干预治疗对改善牙周指数有良好效果,但是难以彻底清除牙周致病菌。     

突变乙型肝炎病毒核心蛋白的克隆及表达

目的 克隆并表达发生长片段缺失的HBV核心蛋白(HBV-C)基因,并对其进行DNA序列、蛋白质结构和抗原性分析.方法 采用PCR方法从1株野生型HBV基因组中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,克隆至pUCm-T质粒,进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析;再将基因编码区克隆至原核表达载体pET-28a,构建含HBV-C基因的重组表达质粒,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达并检测其抗原性.结果 PCR扩增出的HBV-C基因长度经序列分析表明,其核苷酸序列缺失了220 bp至317 bp之间的98个碱基,造成从第74个氨基酸起发生移码突变并失去了抗原性.结论 成功克隆和表达了发生长片段缺失的HBV-C基因.     

肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表达及鉴定

目的探讨肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反应活性。方法对CARDS毒素蛋白的抗原表位进行分析,选取10个重要的表位进行拼接,反向翻译后合成并克隆,插入pET28a表达载体构建pET-CARDS表达质粒并转入受体菌。经IPTG诱导表达的多表位拼接CARDS蛋白使用6×His单克隆抗体和人阳性血清进行了免疫印迹的检测。结果 CARDS毒素蛋白的多表位拼接抗原表达载体构建成功,诱导后表达大小为30KDa的重组蛋白,Western blot测定其能与6×His单克隆抗体和人阳性血清发生反应。结论本研究选取的CARDS毒素蛋白抗原表位具有较强的免疫活性,可为Mp感染的诊断提供新的候选抗原。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体（NS5ATP4A）的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a（＋）质粒,构建pET32a（＋）-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a（＋）-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。     

猪附红细胞体MSG1基因人工合成、克隆、表达及免疫原性分析

目的利用引物重叠扩增法人工合成猪附红细胞体粘附蛋白基因MSG1,并检测其免疫原性。方法将人工合成的猪附红细胞体粘附蛋白基因MSG1产物插入到pMD18 T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28c,构建pET28c_msg1表达载体,转入E.coli BL21,IPTG诱导表达。用SDS PAGE,Western blot方法分析鉴定,表达产物具有很好的抗原性。纯化后的重组蛋白接种昆明小白鼠后,用重组蛋白作为抗原包被酶标板,以检测接种昆明小白鼠血清抗体的产生。结果结果表明MSG1基因在大肠杆菌中能够得到高效的表达,并能够刺激小鼠产生较好的抗体。结论人工成功的合成了猪附红细胞体粘附蛋白基因MSG1,其基因可在大肠杆菌中高效表达,并可刺激小鼠产生较好的抗体。     

刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2基因片段克隆、表达及抗原性分析

目的克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)磷酸甘油酸变位酶2(TgPGAM2)基因片段,并分析其抗原性。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增TgPGAM2基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以兔抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。结果PCR扩增产物约为750 bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-TgPGAM2构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约30 000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析证实其能被兔抗弓形虫血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgPGAM2基因片段可在原核表达系统中表达,且该可溶性重组蛋白具有抗原性。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因，并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后，经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得重组Rv3873蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核表达质粒的构建与表达

目的 构建卡氏肺孢子虫p55抗原基因片段原核重组表达质粒，表达重组蛋白。 方法 SD大鼠皮下注射免疫抑制剂地塞米松14周，建立卡氏肺孢子虫大鼠模型。从感染大鼠肺组织中抽提总RNA，RT-PCR克隆p55基因，测序, 验证扩增产物。利用定向克隆技术将p55基因片段克隆到载体pGEX-4T-1上，重组质粒经酶切分析、PCR鉴定后，用异丙基?鄄β?鄄D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。最后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定表达产物。 结果 克隆的p55基因片段为690 bp, 重组质粒pGEX-4T-1/690构建成功； SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量(Mr)约为62 000，表达产量约占菌体蛋白的11.6%；Western blotting分析结果显示，表达蛋白能分别与谷胱甘肽（GST）抗体、卡氏肺孢子虫感染的大鼠血清发生反应。 结论 构建了卡氏肺孢子虫p55抗原基因的pGEX-4T-1/690重组质粒，诱导表达的蛋白具有良好的抗原性。     

冠状动脉粥样硬化斑块与牙周致病菌的关系

目的 检测冠状动脉粥样硬化斑块中是否存在牙周致病菌,并比较同一患者动脉粥样硬化斑块及其龈下菌斑中的牙周致病菌的一致性,以探讨冠心病和牙周病之间可能的关系.方法 选择51例行冠状动脉搭桥术的患者,术前及术后分别收集龈下菌斑和冠状动脉粥样硬化斑块,采用牙周致病菌特异性引物,通过聚合酶链反应(PCR)技术,检测粥样硬化斑块及龈下菌斑中牙周致病菌的DNA并对扩增产物进行测序分析.结果 51例冠状动脉粥样硬化斑块中,牙龈卟啉单胞菌(P.g)的阳性率33%(17例),福赛类杆菌(T.f)的阳性率31%(16例),中问普氏菌(P.i)的阳性率18%(9例),具核梭杆菌(F.n)的阳性率12%(6例),未检测出伴放线放线杆菌(A.a).51例龈下菌斑中,T.f阳性率84%(43例),F.n阳性率78%(40例),P.i阳性率59%(30例),P.g阳性率39%(20例),A.a阳性率22%(11例);32例患者同时在动脉粥样硬化斑块及龈下菌斑中检测出牙周致病菌.结论 冠状动脉粥样硬化斑块中存在牙周致病菌,牙周致病菌在冠状动脉粥样硬化发生、发展过程中起一定的作用,可能和冠心病发病相关.