dauW基因对柔红霉素产量的影响

报道了先前克隆的柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)dauW基因的过表达和阻断对柔红霉素产量的影响.通过原生质体融合将dauW表达质粒导入天蓝淡红链霉菌DM,所得重组菌DM-W1的柔红霉素产量无明显提高;而通过大肠杆菌-链霉菌接合转移获得的发生同源重组单交换的dauW阻断突变株DM-W2,柔红霉素产量达(192.0±61.6)μg/ml,且遗传稳定性好.试验结果表明,对dauW基因的阻断突变能明显提高柔红霉素的发酵单位.     

天蓝淡红链霉菌SIPI1482菌株graORF1同源基因的克隆

将含有ａｃｔⅢ基因的质粒ｐＩＪ２３４６及其带有ｇｒａＯＲＦ１～４质粒ｐＩＪ５２０５～５２０８作探针与天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２菌种的染色体ＤＮＡ杂交。ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ显示ｐＩＪ２３４６能与２．１ｋｂ的ＢａｍＨⅠ片段杂交；ｇｒａＯＲＦ１能与约６．０ｋｂ和约１０ｋｂＢａｍＨⅠ以及约２０ｋｂＢｃｌⅠ片段杂交。除２．１ｋｂＢａｍＨⅠ片段外，其余的同源片段克隆到质粒ｐＵＣ１８形成几个克隆子，并经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ确认这些同源片段的存在。含有约１０ｋｂ同源ＤＮＡ片段的ｐＹＧ２５，当转化加利利链霉茵３１６１７时，发现能大大地促进该菌株色素的分泌，表明约１０ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段含有某种调节基因。当将质粒ｐＹＧ１１的约６ｋｂＢａｍＨⅠ同源片段克隆到ｐＩＪ６８０构成杂合质粒ｐＹＧ２６并导入变青链霉菌ＴＫ６４，发现同源基因的导入能引起变青链霉菌ＴＫ６４表型的显著变化，表明约６ｋｂ同源基因编码了某些与分化有关的基因。     

柔红霉素产生菌阻断突变株的筛选和鉴别

经NTG和紫外光诱变,从天蓝淡红链霉菌正定变种SIPI 1482中获得了阻断突变株N-18和U-25,通过TLC和HPLC分析,证明这两突变株的主要产物均为ε—紫红霉酮,这表明它们都在生物合成途径的中间步骤被阻断。     

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrX基因的敲除及多柔比星产生菌的构建

柔红霉素是合成重要抗肿瘤抗生素多柔比星的前体,由微生物发酵产生。通过PCR从国内柔红霉素生产菌种天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约1080bp的dnrX部分序列,将PCR扩增片段中985bp的片段亚克隆至大肠埃希菌质粒pYG813构建了同源重组突变质粒pYG963,转化SIPI-1482原生质体并成功地敲除了dnrX基因,得到一株稳定的突变株。该突变株的发酵试验表明dnrX基因所编码的酶的功能已经被有效地阻断,对酸敏感的副产物减少,柔红霉素的产量增加了近3倍,将原野生菌改造成为多柔比星产生菌,发酵效价与原野生菌株柔红霉素的发酵效价相当,为直接发酵法生产多柔比星打下了基础。     

柔红霉素产生菌SIPI89068的选育及发酵

柔红霉素(Daunorubicin)是一种有效的抗肿瘤药物,由它半合成而制备的阿霉素(Adriamycin)是当前首选抗肿瘤药物之一。我院经过几年的生产工艺和劳动保护研究,已将天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubioluszhengdingsis nov .sp.)SIPI1482于浙江海门药厂投入生产。陈代杰等亦作了它的发酵研究报道。但该菌株效价不高,作者以SIPI1482菌株为出发菌,采用传统的物理化学方法处理及柔红霉素耐药处理,选育出一株遗传性能稳定、耐柔红霉素浓度高的新菌株SIPI89068,用于生产上发酵效价高3～4倍。     

天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中dnrV基因的克隆及应用

通过PCR从柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA中扩增出约840bp的目的片段,其中包括了长度为828bp的dnrV全长序列。将dnrV基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a( )及pET-28a( )中,在宿主菌BL21(DE3)中经IPTG诱导后表达,经SDS-PAGE电泳和Western blotting验证正确。进一步将dnrV和doxA基因克隆至链霉菌表达载体pYG505和pYG907并转化SIPI-1482,筛选得到的硫链丝菌素抗性转化子发酵实验证明两个基因的协同表达能提高柔红霉素的产量。     

打靶载体pIJ792的构建

目的利用pIJ790,pIJ773和pUC19等基本质粒,构建金色链霉菌基因打靶筛选体系所需质粒pIJ792。方法以质粒pIJ790为摸板。将PCR扩增的cat基因片段插入到pMD19．T的多克隆位点,得重组质粒pFD31。EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pIJ773．其小片段与pUC19烃同样双酶切后的片段酶连克隆,得新质粒pFD32。pFD31和pFD32再分别经SacⅠ酶切,将pFD31含cat的小片段和pFD32的大片段酶连克隆,筛选得重组质粒pFD33,EcoRⅠ与HindⅢ酶切,将切下的两个小片段与pIJ773经同样双酶切后的大片段进行酶连克隆,最终得筛选质粒pIJ792。结果新质粒pIJ792的抗氯霉素能力超过150μg·mL^-1。结论pIJ792可满足金色链霉菌基因打靶的筛选需要,实现了用于金色链霉菌PCR基因打靶所需筛选体系的构建。     

始旋链霉菌HCCB2003-8 snaA、snaB和snaC基因的克隆、序列分析及原核表达

以始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）HCCB2003—8的染色体DNA为模板，通过优化PCR条件扩增出FMN还原酶、PII．合酶的基因片段。与文献报道的基因序列做同源比较，snaA和snaB碱基序列分别只有一个碱基的差异，snaC碱基序列完全匹配。将snaA、snaB和snaC的基因片段插入原核表达载体pET30a中，并转化至大肠埃希菌BL21（DE3）。SDS—PAGE结果表明。经IPTG诱导后基因分别得到表达。     

质粒PIJ702转化天蓝淡红链霉菌SIPI1482菌种的条件研究

天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２是一株蒽环类抗生素柔红霉素的产生菌，在建立该菌种基因工程研究所需的载体宿主系统的研究中，发现从变青链霉菌分离的质粒ＰＩＪ７０２不能直接转化ＳＩＰＩ１４８２菌种，经排除ＳＩＰＩ１４８２菌种自身内含质粒，试验了热休克衰减ＤＮＡ酶活性，不同时间培养的菌丝体制备的原生质体，ＰＥＧ１０００的浓度以及硫链丝菌素选择时间等因素对ＰＩＪ７０２转化ＳＩＰＩ１４８２菌种的影响，证实上述绪     

柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV基因的克隆及阻断

从柔红霉素产生菌SIPI-1482菌株基因组DNA中PCR扩增得dnmV及其上游dnmU基因片段。利用同源重组对SIPI-1482菌株的dnmV基因进行基因阻断,得到一株遗传稳定的破坏子。验证了在该菌株中进行同源重组所需交换臂长度。     

柔红霉素产生菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482中dnmV因的克隆及阻断

从柔红霉素产生菌SIPI-1482菌株基因组DNA中PCR扩增得dnmV及其上游dnmU基因片段。利用同源重组对SIPI-1482菌株的dnmV基因进行基因阻断，得到一株遗传稳定的破坏于。验证了在该菌株中进行同源重组所需交换臂长度。     

细胞壁缺陷肺炎链球菌青霉素结合蛋白2b基因片段的检测

目的 了解细胞壁缺陷肺炎链球菌青霉素结合蛋白2b基因(pbp2b)片段的检测及其意义.方法 用青霉素诱导肺炎链球菌形成L型,分离稳定L型纯培养物.提取L型染色体DNA,用肺炎链球菌pbp2b序列特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)并检测扩增产物的核苷酸序列,测得序列与GenBank公布的肺炎链球菌R6菌株种特异性pbp2b(628 bp)序列比对.结果 肺炎链球菌稳定L型PCR扩增产物的核苷酸序列与肺炎链球菌R6菌株种特异性pbp2b序列具有99.1%的同源性.结论 细胞壁缺陷肺炎链球菌保留了与肺炎链球菌R6菌株高度同源的种特异性pbp2b基因片段,检测该基因片段可用于肺炎链球菌稳定L型的鉴定.     

中药材龟甲的分子鉴定研究

用PCR产物直接测序法对中药材龟甲(板)进行鉴别。从乌龟 Chinemys revesii 和其他20种产地为中国或东南亚国家的龟类的组织材料中提取DNA,扩增约110bp的线粒体12SrRNA,基因片段并进行序列分析,构建了21种龟类的12SrRNA基因片段序列数据库。序列比较的结果表明乌龟与其它20种龟类的这段序列均有差别,序列差异在3.7～15.7%之间。从江苏省药品检验所提供的19块龟甲检品上各取样0.1～0.5g提取 DNA,扩增与上述相同的基因片段,与构建的数据库进行比较,结果表明19块龟甲中只有3块的原动物为乌龟,其余的龟甲均为混淆品。本文的结果为药材龟甲的鉴定找到了有效、可靠的分子遗传标记方法。     

PCR快速鉴定actinobacteria三种模板制备方法的比较

目的 本研究旨在建立准确、简便、快速的放线细菌鉴定技术，为普通和极端环境放线细菌资源的调查和开发利用创造条件。方法 从放线细菌固体培养基上挑取少量菌体，用微波炉法快速制备基因组DNA作为PCR模板，与液体培养法得到的菌体以超声波法或冻融法制备的模板进行了PCR扩增效果的比较研究。结果P CR检测结果表明微波炉法制备的模板可进行有效的体外扩增，目的条带特异，而超声波法或冻融法并不对所有菌株有效，并有非特异扩增产物产生。结论 组合微波炉法快速制备放线细菌基因组DNA技术和23S rRNA特异插入序列PCR扩增技术建立了准确、简便、快速的actinobacteria鉴别体系。     

阿维链霉菌中aveD基因插入失活产生的异常组分

目的 探索阿维链霉菌中aveD基因插入失活后对发酵产物组分的影响.方法采用将抗生素(安普霉素)抗性基因插入到aveD基因的方法,构建了重组质粒pID03;利用接合转移的方法将重组质粒导人到阿维链霉菌S-2(Streptomyces atwraitilis S-2)菌株中,并通过抗性标记筛选双交换的菌株.结果得到了aveD基因插入失活的菌株AveD24.该菌株不再产生4个A组分,只产生4个B组分,同时还产生2个异常的组分,经HPLC和质谱分析,初步确定异常组分D24-1为寡霉素A,另一异常组分D24-2为5-酮avermectin 1a.     

海马类药材的分子遗传标记鉴定研究

应用古DNA研究技术从5种海马药材中提取DNA,用PCR技术扩增约450bp的12SrRNA基因片段和约490 bp的细胞色素b基因片段。对扩增产物进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析和DNA序列分析。用RFLP分析方法可以鉴别2种海马,用DNA序列分析方法得到的分子遗传标记可以鉴别所有5种海马。对其它动物类药材的鉴定有一定参考价值。     

地鼠多瘤病毒PCR检测方法的建立

目的  建立地鼠多瘤病毒（hamster polyomavirus, HaPyV）PCR检测方法,并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测。方法  设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物,以含HaPyV VP1片段的质粒PMD19T-HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物。以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性。将定量的质粒PMD19T-HaPyV688 10倍系列稀释后进行PCR敏感性检测。以小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus, MuPyV)检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性。应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyV DNA检测。结果  仅含有质粒PMD19T-HaPyV688和MuPyV DNA的样品能够扩增出600 bp的片段,经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VP1特异基因片段。PCR所能检出的PMD19T-HaPyV688和MuPyV 的最少DNA拷贝数分别为5300和590。7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性。结论  建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测。     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。