上海地区小鼠诺瓦克病毒的检测分析及病毒分离

[摘要] 目的 了解上海地区实验小鼠自然感染小鼠诺瓦克病毒（Murine Norovirus,MNV）的状况,并分离毒株。方法 抽取委托检测单位送检的SPF小鼠319只,分别采集盲肠内容物及血液样本,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增小鼠盲肠内容物样本中MNV的特异性基因片段来检测MNV的感染情况,同时采用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）与核酸检测方法进行对比。将RT-PCR扩增结果为阳性的盲肠内容物样本稀释并经0.22μm滤膜过滤,接种到RAW264.7细胞,盲传后采用RT-PCR方法鉴定。结果 RT-PCR检测的319份小鼠盲肠内容物样本中,阳性样本95份,阳性率为29.78%。对180份经RT-PCR检测的小鼠血清进行ELISA检测,阳性样本70份,阳性率为38.89%。RAW264.7细胞盲传5代后在72h内出现细胞病变,经RT-PCR鉴定,显示187bp的目的条带。结论 通过核酸检测方法和血清学方法证实上海地区实验小鼠存在MNV自然感染,且感染率较高,应加强实验小鼠的饲养管理。     

鼠诺如病毒的体外分离与鉴定

目的体外分离出小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)毒株,并对其进行鉴定。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对小鼠进行MNV筛查,将检测出的MNV阳性小鼠的盲肠内容物经过处理接种至鼠源巨噬细胞系RAW264.7细胞,培养一段时间后用RT-PCR法扩增测序。结果成功通过传代RAW264.7细胞分离出MNV,并经过鉴定确认,对RT-PCR扩增序列进行初步分析,与韩国MNV4 S18株同源性最高,达99%。结论 MNV在体外的复制成功,为MNV的生物学特性、致病机制和诊断试剂等方面的研究提供了基础,同时作为人诺如病毒研究的理想模型,对人诺如病毒的研究也有重大意义。     

小鼠泰泽菌抗体IFA检测方法的建立及其与ELISA方法的初步比较

目的 建立小鼠血清中泰泽菌抗体的IFA检测方法。方法 采用IFA方法以泰泽菌抗原片检测人工感染和人工免疫的ICR小鼠血清中抗泰泽菌抗体，并与日本的泰泽菌抗体ELISA检测试剂盒检测结果进行初步比较。结果 用阳性对照血清，抗原片出现特异性蓝绿色荧光，清晰显示出泰泽菌形态，而阴性血清只出现橘红色的本底。在12份人工感染泰泽菌的小鼠早期血清标本中，IFA方法检出4份阳性，8份阴性，阳性检出率33．3％；而ELISA方法检测12份样本均为阴性。另外，在66份人工免疫泰泽菌的小鼠晚期血清样本中，IFA方法检出44份阳性，22份阴性，阳性检出率66．7％；而ELISA方法检出50份阳性，16份阴性，阳性检出率75．7％，结论 建立的小鼠泰泽菌抗体IFA检测方法能够用于小鼠血清中泰泽菌抗体的检测，特别是早期感染的检测。     

重庆地区逆转录病毒的血清学初步筛选调查

本文作者采集重庆地区的成人血清83份和脐带血清95份。将上述血清以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗-HTLV-Ⅲ抗体,以间接免疫灾光法(IFA)检测抗-HTLV-Ⅰ、抗-HTLV-Ⅲ和抗-HTLV-Ⅳ抗体。如标本阳性,则进一步作Western转印杂交斑点(Western blot)试验。结果显示,1份成人血清和2份脐带血清ELISA检测为阳性;而全部标本用IFA法检测均为阴性。该3份ELSA阳性血清再用Western blot证实试验检测,结果亦均为阴性,从而证明ELISA结果阳性者为假阳性。以上结果说明,逆转录病毒感染,包括艾滋病毒(HIV)感染,在四川重庆地区,可能并非常见。ELISA可出现假阳性结果,因此阳性标本必须以Western blot法证实或否定。作者建议应进一步对较大人群和易于感染者作进一步调查。这类调查可以采用简易的IFA法。     

小鼠仙台病毒ELISA抗体检测规范化试剂盒的研制与应用

目的按照实验动物国家标准和农业部对于兽医诊断制品的要求研制小鼠仙台病毒抗体检测试剂盒,并在临床检测中分析其适用性。方法建立仙台病毒的种子批和BHK-21细胞的细胞库;标化仙台病毒生产工艺、抗原蛋白纯化工艺;优化ELISA反应板体系;标化质控血清。使用规范化的ELISA试剂盒对我单位672份送检血清样品进行检测,使用IFA和Western blot方法进行复检。结果病毒的种子批检验表明在-80℃保存半年以上毒力稳定;病毒生产和抗原纯化工艺的标准化提高了抗原生产的稳定性;对照体系的设定降低了环境等变量对于结果判定的影响。在对临床样本的检测过程中发现3种方法的灵敏度ELISA高于Western blot高于IFA。结论规范化的小鼠仙台病毒ELISA抗体检测试剂盒能对小鼠仙台病毒感染状况作出准确判断,具有一定的稳定性和结果可重复性。     

大鼠仙台病毒ELISA、间接免疫荧光和免疫印迹三种检测方法的比较

目的比较ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)、IFA(immuno-fluorescence assay)和WB(Western blot)三种方法在大鼠仙台病毒血清学检测中的差异。方法仙台病毒蛋白抗原经凝胶电泳分离转移后用于血清学检测的WB方法;使用IFA、ELISA方法对20份无菌大鼠、227份SPF大鼠以及63份清洁级大鼠送检血清样品进行检测,阳性及可疑样品用WB方法进行了验证。结果 20份无菌大鼠血清样品被3种方法检测为仙台病毒抗体阴性;SPF级大鼠样品被IFA方法判定为阴性,1.32%(3/227)被ELISA方法判定为阳性,其中有2/3被WB确认为阳性;ELISA、IFA和WB在清洁级大鼠样品中检出仙台病毒的阳性率分别为为18.12%、11.34%和15.87%。结论三种检测方法灵敏度从高到低依次为ELISA、WB和IFA。WB方法可作为IFA和ELISA难以确定结果的替代方法。     

酶联免疫吸附试验检测人血清弓形体IgG、IgM抗体的研究

对ELISA检测人血清弓形体IgG、IgM抗体进行了研究。450份孕妇血清中,ELISA阳性率显著高于IHA;抗体滴度分析,ELISA一般高于IHA2～10倍。25份ELISA IgG抗体阳性血清,TFA检出19份;3份IgM抗体阳性和2份IgG、IgM抗体均阳性血清,IFA分别检出2份。2份阴性和4份含不同抗体滴度的阳性血清于第一次测定后,第7天和第21天测定的阴、阳性结果一致,OD值变异系数为2.43～16.52%。39份阳性血清抗体滴度与OD值呈直线比例关系(r=0.991,p<0.0005)。结果表明,ELISA用于弓形体感染的血清学诊断具有较好的实用性。     

不同途径感染小鼠诺如病毒对小鼠抗体水平和病毒复制的影响

目的探讨小鼠诺如病毒(MNV)不同接种途径对小鼠血清抗体水平和病毒复制的影响。方法 MNV(4×104拷贝/μL)分别以静脉、腹腔联合注射(iv+ip)、饮水(dw)、灌胃(ig)3种不同途径接种ICR小鼠,各组于感染前(0 d)、感染后3 d、6 d、14 d、25 d、34 d、51 d随机剖检2~3只小鼠,收集血清和心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠内容物,利用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时定光定量(q RT-PCR)方法分别检测血清抗体和病毒载量。结果所有感染小鼠均无明显临床症状。3种途径接种的小鼠在感染后25 d均可检测到特异性抗体。抗体产生初期以ig接种组抗体水平最高,随后iv+ip接种组抗体水平上升幅度最大并在51 d高于其它接种组。小鼠接种MNV 3 d可在3组接种鼠的胃肠道、脾、脑中检测到病毒核酸,各组的组织脏器病毒载量有差异,其中iv+ip接种组盲肠内容物(3~51 d)、脾(6 d)和肝(14 d)病毒载量高于其它两组。结论不同接种途径对MNV在小鼠抗体水平和病毒载量影响较大。iv+ip感染效果较好,可作为MNV病毒感染模型的有效接种方式。血清抗体ELISA检测结合盲肠内容物核酸检测有利于MNV早期监测。     

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。     

广东省实验小鼠自然感染鼠诺如病毒的调查

目的了解广东省实验小鼠自然感染小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的情况。方法随机抽取广东省7个繁育设施的小鼠206只,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测其感染MNV的情况。结果共检测小鼠盲肠内容物206份,阳性样本为77份,阳性率为37.38%。3个设施的小鼠感染MNV,各品系小鼠易感性差异无显著。结论证实广东省小鼠存在MNV感染,部分设施小鼠MNV感染率很高,需加强动物的饲养管理。RT-PCR方法可以应用于MNV感染检测。     

猴D型逆转录病毒p27基因的原核表达及流式免疫荧光微球检测技术的建立

目的构建猴D型逆转录病毒的p27蛋白,并建立流式免疫荧光微球检测技术用于猴D型逆转录病毒的检测。方法通过PCR扩增p27基因片段,与p GEX-4T-1表达载体进行连接,转化至BL21(DE3)进行表达。通过SDS-PAGE分析蛋白表达的形式及最佳诱导时间。采取GST树脂纯化目标蛋白,包被磁珠,建立流式免疫荧光微球检测技术,用于临床样本的检测。结果重组蛋白以可溶的上清液进行表达,诱导的最佳时间为4 h。包被磁珠后,成功建立流式免疫荧光微球检测技术,对阳性血清稀释81倍仍可检测为阳性,对猴类其他病原的阳性血清无交叉反应,特异性强,与ELISA法同时对24份临床样本进行检测,其中3份样品的流式免疫荧光微球检测结果为阳性,ELISA检测结果为2份阳性,1份阴性,两种方法的检测结果符合率为96%。结论成功表达猴D型逆转录病毒p27蛋白,并运用该蛋白建立了灵敏度高,特异性强,样本需求少的流式免疫荧光微球检测技术,为后续推广应用多重流式免疫荧光微球检测技术奠定了基础。     

实验大鼠泰泽病原体三种检测方法的比较

目的 利用不同的检测方法调查了解我国实验大鼠中泰泽病原体的携带情况,并比较三种方法的检测结果,为合理选择实验室检测方法提供依据.方法 应用ELISA法,间接免疫荧光（IFA）法和套式PCR法三种检测方法对国内大型实验动物生产厂家送检的125只实验大鼠同时进行泰泽病原体检测,并对比分析检测结果,评估我国实验大鼠泰泽病原体的携带情况.结果 共检测125只实验大鼠,其中清洁级54只,SPF级71只,IFA法检出36只阳性,89只阴性,阳性检出率28.8%：ELISA法检出24只阳性,101只阴性,阳性检出率19.2%：PCR法检出6只阳性,119只阴性,阳性检出率4.8%;ELIsA法和IFA法阳性检出率要高于PCR法.结论 对于泰泽病原体的检测,可以采用IFA法或ELISA法进行抗体检测,对可疑的样品用PCR法验证.相比而言,IFA法具有简单,可靠、价格低廉的优点,可以用于实验大鼠泰泽病原体感染状况的初步调查和流行病学监测.     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

间接免疫荧光法检测麻疹抗原在麻疹早期诊断中的临床应用

目的:探讨间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence Assay,IEA)检测麻疹病毒抗原对儿童麻疹病毒(measles virus,MV)感染的早期诊断价值.方法:观察86例临床诊断麻疹的患儿,在发病的不同阶段IFA检测痰液MV抗原和酶联免疫吸附试验(engymelinked imgmunosorbent assay,ELISA)检测血清中MV特异性LgM抗体,采集30份上呼吸道感染患者痰液进行IFA麻疹病毒抗原检测,比较分析检测结果.结果:86例中发病7 d内IFA测抗原ELISA测抗体两种方法的阳性率为分别为97.1%和16.2%;7 d后为33.3%和88.9%,P均＜0.01.IFA测抗原阳性率与检测时间的相关系数为-0.91,P=0.02;ELISA测抗体阳性率与检测时间的相关系数为0.97,P=0.04.30份对照组的标本MV抗原检测均为阴性,IFA测抗原的特异性与敏感性分别是100%和97.1%.结论:IFA测抗原在疾病早期检出阳性率高,阳性检出率与检测时间成负相关,IFA测抗原痰液麻疹病毒抗原是一种早期快速、特异敏感的实验室检测方法.     

猴B病毒抗体不同检测方法的比对

目的猴B病毒(monkey B virus,BV),也称猴疱疹病毒I型(Cercopithecine herpesvirus 1),是重要的人兽共患病原。根据国家标准,猴B病毒作为抗原检测抗体,但由于生物安全问题,抗原制备受到很大限制,因此使用替代抗原进行抗体血清学检测并进行比对验证。方法应用2种ELISA方法(抗原分别为BV和HVP2)和1种免疫酶法EIA方法(抗原为HSV-1)对本实验室135份送检恒河猴血液样品进行筛查,对阳性及可疑样品再以免疫荧光法IFA和Western blot方法(抗原为HSV-1)以及以HSV-1 g C1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法验证。结果HVP2-ELISA、BV-ELISA和HSV-1-EIA阳性检出率分别为32.6%、37.8%和34.8%;3种方法检测结果一致的样品占91.1%(123/135),阳性结果可被IFA和WB确证;可疑样品12份,33.3%(4/12)的样品经验证检验为阳性。结论与BV抗原相比,替代抗原HSV-1的敏感性和特异性较HVP2更为接近;阳性样品及可疑样品的确证检验应使用多种方法,避免漏检。     

游离SIVmac239病毒与T细胞介导两种方式感染内皮细胞的效果比较

目的比较游离病毒感染与T细胞介导的感染方式对SIV感染内皮细胞的影响,探索SIVmac239感染内皮细胞的主要途径,从而为SIV入侵血脑屏障的机制提供理论基础。方法采用游离SIV病毒直接感染内皮细胞和SIV感染的CEMx174细胞与内皮细胞共培养的两种方式,通过巢式PCR、间接免疫荧光法、Western blotting以及ELISA检测内皮细胞的感染程度。结果两种感染方式都能在内皮细胞内检测到前病毒DNA,感染细胞与内皮细胞共培养时,内皮细胞内前病毒DNA含量,SIV P27蛋白表达量和细胞培养上清液中P27含量远高于游离病毒直接感染的方式。结论细胞介导的感染方式相较于游离病毒直接感染方式对内皮细胞的感染能力更强,可能是SIV病毒入侵血脑屏障的主要途径。     

两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA提取效能的比较

目的 比较两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA的提取效能.方法 用Trizol提取法和QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法分别提取感染小鼠诺如病毒(Murine Norovirus,MNV)的小鼠小肠组织样品RNA和细胞培养物RNA,测定RNA浓度;用MNV特异的引物对分离的核酸样品进行一步法RT-PCR扩增.结果 Trizol提取法提取小肠组织的RNA浓度高于QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法;QIAamp Viral RNA Mini Kit提取得到的细胞培养物RNA浓度高于Trizol提取法.经QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的两种核酸样品均能扩增出特异条带,而Trizol提取的核酸样品未见特异条带.结论 在MNV的检测中,QIAamp Viral RNA Kit更适合组织样品中MNV病毒核酸的提取.     

单纯疱疹病毒感染诊断方法及标本选择的探讨

目的目的探讨单纯疱疹病毒（HSV）感染诊断方法及标本的选择对诊断结果的意义。方法选择117例疑似HSV感染的皮肤科门诊患者或神经内科脑炎脑膜炎患者血清，其中53例有明显疱疹症状者同时取疱液标本，78例脑炎脑膜炎患者同时采集脑脊液标本。应用ELISA法、免疫印迹法检测血清、脑脊液中HSV—IgM抗体，应用间接免疫荧光法（IIF）检测脑脊液、疱疹液HSV抗原。结果血清、脑脊液标本ELISA法和免疫印迹法检测HSV—IgM抗体阳性率分别为70．94％、6．41％和59．83％、3．85％。脑脊液、疱疹液TIF法检测HSV抗原阳性率分别是15．38％、67．93％。结论ELISA法与免疫印迹法检测HSV—IgM抗体阳性率无显著性差异（γ=0．017，P〉0．5）；脑脊液标本供检测HSV抗原与HSVIgM抗体的阳性率差异显著（γ=13．224，P〈0．05．）；对复发感染患者采用疱疹液抗原检测相对于采用血清检测抗体对诊断HSV感染更具有临床意义。在临床上，对不同病症病程的HSV感染，选择相应适宜的诊断方法及标本种类可取得更准确的检测结果。     

抗-HCV ELISA法检测结果在临界值附近的风险探讨

目的应用化学发光免疫分析（CLIA）法,检测抗-HCVELISA法结果在临界值附近（O．4≤S／CO〈1）的血清标本,探讨HCV感染的风险性。方法笔者对19份抗-HCVELISA法检测结果在临界值附近,胶体金法均阴性的血液标本,分别经抗．HCVELISA法试剂①、试剂②、胶体金法和CLIA法试剂进行了检测。结果HCV-CLIA法阳性16份、ELISA法试剂①和试剂②分别阳性5份9份,胶体会法阳性0份。cuA法与ELISA法和胶体金法比较检出率灵敏度显著高于ELISA法（P〈0．05或P〈0．01）和胶体金法（P〈0．01）。结论抗-HCVELtSA法检测结果在临界值附近的血液标本存在HCV感染的可能．尤其是献血者标本存在感染受血者的风险。对可疑标本应更进一步的应用丙型病毒性肝炎核心抗原检测法、CLIA法、核酸扩增和微流芯片法或RNART—PCR荧光定量法进行检测,以保证结果的准确性。     

稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株的筛选与鉴定

目的建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株。方法将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS-1细胞,经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株,并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物。结果筛选所得稳定表达细胞株经RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测均呈阳性反应,而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应。结论筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株,命名为NS/HBc-Mep。为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞。