腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的 以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC)，增强VSMC中gax基因的表达。方法 采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)，经293细胞扩增，纯化制备高滴度病毒转染液；以病毒转染液常规转染VSMC后，应用RT—PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达。结果 流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示．AdCMV—gax转染VSMC后，VSMC的Gax蛋白表达率明显增高，转染后24小时即可达80％左右，高水平的表达可维持5天以上；AdCMV—gax转染前，PDGF—BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用，AdCMV—gax转染后，无论有无PDGF—BB刺激，VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。结论 腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC，并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响。     

前蛋白转化酶枯草溶菌素9小分子干扰RNA对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因沉默后对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,初步探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)蛋白表达在其中的作用。方法建立PCSK9小分子干扰RNA(siRNA)模型,培养VSMC,分为空白对照组、阴性转染组和阳性转染组,选取转染效率最高的PCSK9siRNA对VSMC进行干预,分别于12、24、36、48、60h用MTT法测定吸光度(A)值,绘制增殖曲线,观察其对VSMC增殖的影响,转染48h后用Western blot印迹法检测细胞内LRP-1蛋白表达情况。结果与阴性转染组比较,阳性转染组24、36、48和60h的A值明显下降(P<0.05),PCSK9siRNA抑制VSMC的增殖(P<0.05)。与空白对照组和阴性转染组比较,阳性转染组LRP-1蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论 PCSK9siRNA能有效抑制VSMC的增殖作用,且这种作用可能与LRP-1蛋白表达上调有一定的关系。     

反义EGFR寡核苷酸对AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖效应的影响

目的探讨脂质体介导的反义表皮生长因子受体（EGFR）寡核苷酸基因转染对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）促大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。方法用EGFR寡核苷酸脂质体复合物转染Sprague-Dawley大鼠VSMC,通过RT-PCR、Western-Bloting分别检测转染后EGFR mRNA及蛋白的表达情况,用3H-Tdr掺入法检测经EGFR寡核苷酸转染再用AngⅡ刺激VSMC的增殖情况。结果反义EGFR寡核苷酸转染大鼠VSMC后,EGFR mRNA及蛋白的表达较正义组及对照组显著减少（P<0.01）;用AngⅡ刺激后,反义组细胞的3H-Tdr掺入较正义组及对照组显著降低（P<0.01）。结论脂质体介导的反义EGFR寡核苷酸转染可以减弱AngⅡ的促VSMC增殖效应。     

高迁移率族蛋白1及其受体促进人主动脉血管平滑肌细胞增殖及迁移的作用研究

目的研究高迁移率族蛋白1(HMGB1)及其受体对体外人主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移的影响。方法体外培养人VSMC株,50、100、200μg/L HMGB1作用细胞24 h后,CCK法检测VSMC的增殖情况;细胞划痕修复及Transwell小室实验检测VSMC迁移情况;Real-time PCR及Western blot检测细胞晚期糖基化终产物受体(RAGE)干扰效率;CCK法及Transwell小室实验检测沉默RAGE后HMGB1对细胞增殖及迁移的影响;Western blot检测核因子(NF-κB)蛋白表达水平。结果 HMGB1作用VSMC后可明显促进细胞增殖及迁移(P0.05);转染si RNA-RAGE后,RAGE的m RNA及蛋白表达水平明显下降(P0.05);与HMGB1组相比,si RNA-RAGE可抑制HMGB1诱导的细胞增殖、迁移及NF-κB蛋白表达(P0.05)。结论 HMGB1可促进VSMC增殖及迁移,机制可能与HMGB1和RAGE结合后激活NF-κB表达有关。     

可罗卡林对血管平滑肌细胞增殖及c-myc基因表达的影响

目的：观察对大鼠主动脉平滑肌细胞起负调节作用的可罗卡林(cromakalim对同型半胱氨酸(hcy)刺激的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖及c—myc基因表达的影响。方法：在建立hcy诱导的平滑肌细胞增殖模型后，应用流式细胞术观察VSMC增殖周期的变化；并用免疫细胞化学方法观察可罗卡林对VSMC增殖及c—myc基因蛋白表达的影响。结果：可罗卡林使VSMC处于G0／G1期的细胞数显著增多(P＜0．01)，S期G2 M期的细胞数显著减少(P＜0．01．)，能够抑制hcy诱导的VSMC增殖和c—myc基因蛋白表达的增加。结论：可罗卡林对hcy诱导的VSMC增殖有显著的抑制作用，其作用机制与抑制c—myc基因表达有关。     

血管紧张Ⅱ2型受体转染表达对血管平滑肌细胞殖及迁移的影响

目的 探讨血管平滑肌细胞（VSMC）转染表达血和这紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）对其增殖和迁移影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制缺隐型腺病毒载体（AdCMV-AT2R）,体外转染大鼠主动脉VSMC,用RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,流式细胞仪检测AT2R表达率,用细胞周期、分裂指数、MTT比色法和5－溴尿苷（BrdU）掺入法检测VSMC增殖。VSMC迁移用改良Boyden‘s趋化小室法检测,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F－actin的表达。结果 构建的AdCMV－AT2R体外转染培养VSMC表达率为89．51％。AT2R峰值地,其S期和G2－M期细胞比率从31．7％降低到13．9％（P＜0．05）,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61．14％和51．6％（P＜0．01）。VSMC的跨膜迁移数降低62．2％,F-actin表明明显减少。结论 AT2R转染表达可显著抑制体外培养VSMC的增殖和迁移,这一作用对再狭窄防治是有益的。     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),增强VSMC中gax基因的表达.方法采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax),经293细胞扩增,纯化制备高滴度病毒转染液;以病毒转染液常规转染VSMC后,应用RT-PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达.结果流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV-gax转染VSMC后,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高,转染后24小时即可达80%左右,高水平的表达可维持5天以上; AdCMV-gax转染前,PDGF-BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用,AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.结论腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC,并且表达为蛋白质.这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响.     

血管紧张素Ⅱ介导的大鼠血管平滑肌细胞STAT1激活与核转位

目的 检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）介导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖过程中信号转导和转录活化因子-1（STAT1）的激活与核转位。方法 本文采用Western印迹、非同位素凝胶电泳（EMSA）和免疫荧光染色的方法，观察AngⅡ刺激大鼠主动脉VSMC前后，细胞中STAT1的活化状态与定位。结果 VSMC经AngⅡ干预后，胞内磷酸化的STAT1（P-STAT1）蛋白表达增加（P〈0．01），达峰后随时间梯度逐渐下降，AngⅡ干预15min后检测到胞核内有蛋白．DNA复合物形成。这一反应可被血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1）阻滞剂Losartan以及Jak2抑制剂AC-490抑制（P〈0．01）。免疫荧光染色结果也显示AngⅡ干预后P-STAT1主要在胞核内表达。结论AngⅡ可以通过和AT1受体结合，激活Jak／STAT通路，在AngⅡ介导的大鼠VSMC增殖过程中发挥作用。     

miR-155通过调控CaSR表达影响VSMC生长的机制研究

目的 miR-155可以通过干扰血管平滑肌细胞(VMSC)生物活性来抑制动脉粥样硬化斑块的形成,但具体机制不十分清楚。本研究主要观察miR-155对VSMC中钙敏感受体(CaSR)表达的影响,同时探讨CaSR在miR-155调控VSMC生物活性过程中的作用。方法培养VSMC,将miR-155 mimic、Ad-CaSR转染到VSMC中,Western blot检测相关基因的表达,MTT测定VSMC生长情况,流式细胞术检测VSMC的凋亡情况,Transwell检测VSMC迁移情况。结果 miR-155 mimic组CaSR的表达水平明显受抑制,VSMC凋亡明显减少,而VSMC的增殖和迁移能力明显增强;Ad-CaSR组和miR-155+Ad-CaSR组VSMC凋亡明显增加,而VSMC的增殖和迁移能力明显下降。结论 miR-155可以调控VSMC的生长,该作用可能是通过影响VSMC中CaSR的活性得以实现。     

转录因子SP1调控血管平滑肌细胞表型转化在主动脉夹层发病中的作用

目的:探讨转录因子SP1在主动脉夹层组织中的表达情况及与主动脉夹层血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化的关系。方法:收集人主动脉夹层血管壁组织(n=10)及正常主动脉壁组织(n=4),分别采用RT-PCR和Western blot检测主动脉壁组织中SP1和收缩型VSMC表型标志物SM22α的mRNA和蛋白表达水平;体外培养正常人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC),以转染SP1过表达腺病毒(Ad-SP1)的HA-VSMC为Ad-SP1组,以转染仅表达荧光蛋白腺病毒(Ad-GFP)的HA-VSMC为对照组,分别采用RT-PCR和Western blot检测转染后HA-VSMC中SM22αmRNA和蛋白表达水平。结果:与正常主动脉壁组织相比,人主动脉夹层血管壁组织中SP1 mRNA(3.81±2.84对0.91±0.67,P0.05)和蛋白(2.09±0.32对0.90±0.09,P0.05)表达水平均明显升高,SM22αmRNA(0.39±0.20对1.01±0.51,P0.05)和蛋白(0.75±0.10对1.01±0.09,P0.05)表达水平均明显下降;腺病毒转染HA-VSMC后,与对照组相比,Ad-SP1组中SM22αmRNA(0.36±0.03对0.95±0.11,P0.05)和蛋白(0.84±0.11对1.06±0.06,P0.05)表达水平均明显下降。结论:转录因子SP1在主动脉夹层组织中表达水平升高,与VSMC表型转化密切相关,参与主动脉夹层的发病过程。     

紫杉醇对大鼠血管平滑肌细胞G_1-S检查点作用的研究

目的:探讨紫杉醇对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)和血管内皮细胞(VEC)G1-S检查点的作用。方法:将大鼠VSMC与VEC进行原代培养,50 nmol/L紫杉醇干预72 h后进行免疫荧光染色和蛋白印迹法检测。结果:同VEC相比,紫杉醇干预的VSMC中BrdU表达明显增加(均P0.05)。紫杉醇干预的VSMC中cyclin D1、P27表达高于VEC,P21表达较低(均P0.05)。结论:紫杉醇干预的VSMC同VEC相比,在增殖率与细胞周期调节因子表达方面具有明显差异,紫杉醇对VSMC G1-S检查点有特异性调节作用。     

缬沙坦对血管平滑肌细胞迁移及丝裂原活化蛋白激酶的影响

目的观察缬沙坦（Val）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激下大鼠血管平滑肌细胞（VsMC）迁移及磷酸化42／44丝裂原活化蛋白激酶（p42／44MAPK）表达的影响。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,tran-sweⅡ小室检测细胞的迁移能力,免疫印迹法检测p42／44MAPK蛋白表达的水平。结果（1）AngⅡ能明显促进VSMC迁移,该作用可被Val和MAPK激酶的特异性抑制剂PD98059所抑制。（2）AngⅡ刺激VSMC5min时,p42／44MAPK的表达量最大,该作用可被Val和PD98059所抑制。（3）Val单独作用于VSMC时,对细胞的迁移及p42／44MAPK的表达均无明显影响。结论Val抑制AngⅡ诱导的VSMC迁移与其抑制AngⅡ诱导的p42／44MAPK的表达相关。     

葛根素对血管平滑肌细胞增殖及增殖细胞核抗原和凋亡抑制蛋白表达的影响

目的:通过观察葛根素对培养的脐动脉平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和凋亡抑制蛋白(Survivin)表达的影响,探讨葛根素抑制平滑肌细胞增殖的机制。方法:分离培养人脐动脉平滑肌细胞,加入不同浓度葛根素与细胞孵育,采用免疫组化法检测血管平滑肌细胞的PCNA表达;提取RNA,采用Rt-PCR检测Survivin表达水平,并经核苷酸序列分析验证,灰度扫描测定Survivin/GAPDH(s/G)比率。结果:葛根素抑制血管平滑肌细胞的PCNA表达(P=0.0000);葛根素组Survivin/磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(s/G)比率较对照组低。结论:葛根素具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。     

人大隐静脉与胸廓内动脉平滑肌细胞生长特性的比较

目的：探讨人大隐静脉（saphenous vein,SV）与胸廓内动脉（internal thoracic artery,ITA）血管平滑肌细胞（VSMCs）的原代培养及传代培养的方法,并比较二者的生长特性。方法：取冠状动脉搭桥术后剩余的SV与ITA血管标本,分为SV组与ITA组,用植块法进行VSMCs的原代培养,用免疫荧光染色法鉴定细胞,并比较两组细胞培养时间的差异。去血清培养48h后,在DMEM／F12、100ml／LFBS及10ng／ml血小板源性生长因子（PDGF）-BB不同培养条件下,观察SV的VSMCs与ITA的VSMCs生长情况。用MTY比色法检测细胞增殖并进行比较。结果：原代及传代培养均获成功。免疫荧光染色法显示平滑肌肌动蛋白（SMα-actin）位于细胞质,总阳性率〉95％。SV组原代培养植块周围细胞爬出时间为（9．1±1．1）d,大于ITA组的（5．8±1．0）d（P〈0．05）。sV的VSMCs再次传代培养时间为（34．9±3．4）d大于ITA的VSMCs首次传代培养时间（29．1±4．4）d（P〈0．05）。SV的VSMCs再次传代培养时间为（9．0±4．2）d,与ITA的VSMCs再次传代培养时间（9．6±3．9）d相似。两组细胞在相同培养条件时,未见明显的形态学差异,细胞生长曲线的差异无统计学意义。结论：采用植块法进行SV与ITA的VSMCs原代培养简便可行,细胞纯度高,具有良好的细胞表型转变特性,是研究冠状动脉搭桥术后血管桥再狭窄分子机制良好的细胞模型。SV的VSMCs可能较ITA的VSMCs具有更强的增殖潜能,二者内在属性的差异仍有待于进一步研究。     

胰岛素对血管平滑肌α肌动蛋白基因变异的影响机制

胰岛素不仅能维持血管平滑肌细胞的静止形态,也能促进血管平滑肌细胞的迁移.胰岛素这种不同的效应是通过血管平滑肌细胞表型标志物α-平滑肌肌动蛋白实现的,因为α-平滑肌肌动蛋白在血管平滑肌细胞静止形态中高表达,而在血管平滑肌细胞迁移形态中低表达.胰岛素维持血管平滑肌细胞静止形态是通过磷脂酰肌醇激酶3途径实现的,而其促进血管平滑肌细胞迁移是通过活化蛋白激酶实现的.因此,在模拟胰岛素抵抗状态,即阻断磷脂酰肌醇激酶3信号通路并保留活化蛋白激酶信号通路,胰岛素可能失去维持血管平滑肌细胞的静止状态,取而代之的是促进血管平滑肌细胞的迁移.α-平滑肌肌动蛋白的变异能引发许多血管性疾病,包括冠心病、缺血性脑卒中等.α-平滑肌肌动蛋白的单基因也变异能引发弥漫性血管疾病,包含了动脉的阻塞及扩大,这在临床上对血管性疾病的研究和治疗有直接的指导作用.     

MicroRNA-223及MMP-9在风湿性心瓣膜病合并心房颤动患者中的表达及临床意义

目的 探索miRNA-223与金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）在风湿性心瓣膜病（风心病）合并心房颤动（房颤）患者的表达水平及在房颤心肌结构重构的发生机制.方法 风心病接受瓣膜置换术患者31例,其中风心病窦性心律组15例,风心病慢性房颤组16例.收集患者右心房心肌组织,实时荧光定量聚合酶链反应检测心房肌组织和血清miRNA-223的相对表达量.酶联免疫吸附试验及免疫组织化学检测血清及心肌组织MMP-9蛋白的表达及分布水平;苏木素-伊红染色及Masson染色观察心肌组织病理结构及胶原纤维含量变化.结果 与窦性心律组相比,房颤组心房肌组织miRNA-223表达水平升高,差异有统计学意义（0.0603±0.0228 vs.0.0261±0.0035,P＜0.01）;房颤组血清MMP-9表达水平高于窦性心律组,差异有统计学意义[（4.2281±0.9165）ng/mLvs.（2.7613±1.2166）ng/mL,P＜O.05].MMP-9蛋白表达水平与胶原容积分数（collagen volume fraction,CVF）呈正相关（r=0.406,P＜0.05）;MiRNA-223表达水平与MMP-9蛋白表达呈正相关（r=0.901,P＜0.05）.结论 房颤患者心房组织中miRNA-223及MMP-9蛋白表达水平均升高.     

白细胞介素-4对巨噬细胞缺氧诱导促有丝分裂因子分泌的影响

目的：探讨白细胞介素-4（IL-4）对巨噬细胞缺氧诱导促有丝分裂因子（HIMF）分泌及HIMF对血管平滑肌细胞增殖的影响。方法：用不同剂量的重组IL-4刺激培养的巨噬细胞，以逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测巨噬细胞HIMFmRNA表达，荧光免疫组化激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞HIMF蛋白表达；用终浓度分别为3×10^-4mmol／L，9×10^-4mmol／L，2．7×10^-5 mmol／L的重组HIMF刺激培养的平滑肌细胞，以^3 H-胸腺嘧啶核苷（^3 H—TdR）掺入法测定HIMF对平滑肌细胞增殖的影响。结果：Th2型细胞因子IL-4刺激巨噬细胞，HIMFmRNA及其蛋白明显表达（P〈0．01）；浓度为3×10^-6 mmol／L，9×10^-4～mmol／L，2．7×10^-5mmol／L的重组HIMF明显促进平滑肌细胞增殖（与对照组比较P〈0．01），且随着HIMF剂量的增加，促增殖作用增强。结论：Th2型细胞因子IL-4能刺激巨噬细胞表达HIMF mRNA及其蛋白，HIMF能促进体外培养的血管平滑肌细胞增殖。     

血管平滑肌细胞凋亡与动脉粥样硬化研究进展

血管平滑肌细胞是构成血管壁的重要组成成分,其凋亡参与了动脉粥样硬化及再狭窄的发生发展,现就最近研究对血管平滑肌细胞凋亡诱导因素、相关基因、及其在动脉粥样硬化发生发展作用作一综述。     

地尔硫卓对增殖血管平滑肌细胞的原癌基因表达的影响

目的观察地尔硫卓（Dil）对增殖血管平滑肌细胞（VSMC）的原癌基因c-myc、c-fos、c-jun和ras mRNA表达的影响。方法将组织贴块法培养的大鼠胸主动脉VSMC随机分为5组,即空白组、模型组和Dil1、2、3组（浓度分别为10^-5、10^-6、10^-7mol/L）,应用MTT检测增殖能力,用流式细胞术检测VSMC的增殖指数,用rt-PCR检测c-myc、c-fos、c-jun和ras mRNA的表达。结果与模型组比较各浓度Dil都能抑制VSMC增殖,PI值均显著下降（各组PI值分别为21.53±1.72、28.63±0.96、15.95±0.37、19.28±0.94、20.33±0.67;P〈0.05）;Dil1、2组c-myc、c-fos、c-jun mRNA的表达显著减少（模型组和Dil1、2组的c-myc/GAPDH值分别为2.454±0.03、1.509±0.05、1.660±0.04,c-fos/GAPDH值分别为0.0046±0.0004、0.0023±0.0003、0.0038±0.0005,c-jun/GAPDH值分别为1.950±0.03、1.077±0.03、1.725±0.03;P〈0.05）,rasmRNA的表达显著增加（模型组和Dil1、2组的ras/GAPDH值分别为1.941±0.03、3.811±0.02、2.501±0.02;P〈0.05）。结论Dil抑制VSMC增殖机制可能与下调原癌基因c-myc、c-fos、c-jun的表达和上调ras的表达有关。