HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻保存研究

目的研究OPS法对不同基因型的HBV转基因小鼠胚胎玻璃化冷冻的效果，为建立转基因小鼠胚胎库奠定基础。方法采用乙二醇作为冷冻保护剂，以野生型P21^ / 小鼠为对照，用OPS法对P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx两种HBV转基因小鼠3．5d的胚胎进行玻璃化冷冻，并比较不同基因型小鼠的超数排卵数，胚胎的复苏率及发育率。结果P21^ / 、P21^HBsAg／HBsAg及P21^HBx/HBx小鼠平均超排数分别为27．89、15．56、9．14枚；复苏率分别为88．7％、81．1％、80．3％；发育率分别为82．6％、79．4％、56．6％。结果表明HBV转基因小鼠的超排数明显低于野生型小鼠的超排数，解冻后三种小鼠的胚胎复苏率之间无显著差别，而解冻后发育率，P21^HBx／HBx小鼠要明显低于其它两种小鼠。结论超排数、胚胎复苏率及解冻后发育率受小鼠的基因型影响。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

自制载体冷冻小鼠原核期胚胎效果分析

目的 探讨自制冷冻载体冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎的可行性.方法 首先,比较了两种流行的商业化载体:开放式拉长麦管(open pulled straw,OPS)和冷冻帽(cryotop)开展小鼠原核胚玻璃化冷冻保存效果.其次,以cryotop为对照,利用自制简易载体(cryotip)开展小鼠原核期胚胎的玻璃化冷冻保存.之后,利用ANOVA对各组胚胎在复苏后的体外培养卵裂率、囊胚率进行统计分析.结果 OPS和cryotop两组之间,胚胎在玻璃化冷冻/复苏后发育的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率差异均无显著性(P＞0.05),但cryotop冷冻效果更接近对照组;cryotip玻璃化冷冻载体与cryotop相比,胚胎复苏后各组差异均无显著性(P＞0.05),数值上除了2-细胞发育率外,cryotip其他几项结果都稍微高于cryotop组.结论 OPS,cryotop,cryotip冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎均是可行的;cryotop在冷冻效果上要优于OPS,笔者自制的cryotip因其成本低,制作简单,操作安全可靠,在实验中替代昂贵的商业化载体OPS和cryotop是可行的.     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型的冷冻保种技术。 方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测。结果 冷冻体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的复苏率是67.78%?.08,移植产仔率是21.31%?.09,后代的阳性率是23.08%?.14;冷冻体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,复苏率是63.33%?.03,移植产仔率是15.56%?.04,后代的阳性率是33.33%。 结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法。     

OPS两步法玻璃化冷冻小鼠8-细胞胚胎生存发育率的研究

目的为实验动物、家畜和人类胚胎的冷冻保存探索简易、高效的玻璃化冷冻程序。方法以小鼠8-细胞胚胎为材料,在25℃室温和37℃恒温台条件下,利用玻璃化冷冻溶液EDFS30, 对小鼠8-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存,解冻后培养60 h后的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标,同时对解冻后培养1-3 h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。OPS(Open-pulled straw)两步法冷冻保存,即胚胎首先移入预处理液(10％EG 10％DMSO)中平衡30 s,再移入玻璃化溶液中吸入OPS平衡15、25、35、45和60 s连同胚胎直接投入液氮中冷冻保存。结果小鼠胚胎8-细胞冷冻后囊胚发育率最佳组高达95．6％,与对照组(96．8％)差异无统计学意义(P> 0．05)。利用最佳冷冻组获得的165枚胚胎移植于11只假孕63-67 h的受体母鼠,结果有4只妊娠,产仔23只,妊娠产仔率为38．3％(23/60),与对照组37．9％(22/58)差异无统计学意义(P>0．05)。结论 EDFS33为玻璃化冷冻液,OPS两步法能有效地冷冻保存小鼠8-细胞胚胎。     

转基因技术和冷冻胚胎技术的实验数据建立

目的 建立一系列转基因技术和冷冻胚胎技术的实验室数据库。方法 a)显微注射法注射1864个1-细胞期受精卵,注射后存活的1283个胚胎进行胚胎移植,获得20只阳性转基因动物。b)设计不同单位的激素剂量(PMSG HCG)获得每个品系的小鼠平均排卵量和最佳激素剂量。e)采用常规法和玻璃化法进行胚胎冷冻保存,并就囊胚和桑椹胚两个不同时期进行复苏成活率的比较。结果 和讨论a)建立转基因技术和胚胎冷冻保存的实验数据库(随着实验技术的不断提高还将不断的完善)。胚胎显微注射存活率为68．8％;转基因阳性鼠出生率为16．16％;基因整合率为1．56％。b)激素诱发5种品系小鼠的平均超排卵数为：C57BL/6J(日本)15．6;C57BL/6J 19．6;BDF1(日本)21．4;C3H(日本)14．8;KM 30。e)胚胎冷冻保存复苏,出生幼子存活率为30％～31％。     

不同胚胎冷冻方法对人类早期胚胎解冻后的复苏效果及临床结局的影响

目的 比较玻璃化冷冻与程序化冷冻对人类早期胚胎解冻后复苏效果及临床结局的影响.方法 辅助生殖技术获取的剩余可利用人类胚胎2 884枚,其中采用玻璃化冷冻复苏666个周期,解冻胚胎1 516枚、复苏1 383枚、移植胚胎1 375枚;程序化冷冻复苏506个周期,解冻胚胎1 368枚、复苏1 090枚、移植1 077枚.比较两种方法的复苏效果及临床结局.结果 玻璃化冷冻组胚胎复苏率、胚胎完整率分别为92.02％、92.11％,高于程序化冷冻组的79.68％、69.63％(P＜0.05);两组种植率、临床妊娠率、周期取消率、多胎妊娠率、早期流产率、新生儿胎龄、早产率、新生儿出生体重、出生缺陷率比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 玻璃化冷冻较程序化冷冻有更高的胚胎复苏率及胚胎完整率,胚胎利用率高,两种冷冻方法的临床结局相似,适用于人类胚胎的冷冻.     

影响冻融胚胎复苏率和移植成功率因素分析

目的探讨影响冻融胚胎复苏率和移植成功率的相关因素。方法回顾性分析573个冷冻胚胎移植（FET）周期的临床资料,按冷冻前胚胎质量、胚胎发育时间、解冻后胚胎复苏程度和冷冻方法分别进行分组,分析不同分类各组间的胚胎复苏情况和（或）临床妊娠率差异。结果冷冻当天胚胎中有优质胚胎者的临床妊娠率显著高于无优质胚胎者（31．8％vs20．0％）（P〈0．05）。受精第2天冷冻者与受精第3天冷冻者的胚胎复苏率和临床妊娠率差异无统计学意义（79．1％vs82．9％和25．5％vs31．2％）（P〉0．05）。解冻后完全移植100％卵裂球完整者和混合移植者的临床妊娠率显著高于完全移植部分卵裂球损伤者（36．7％vs24．1％和29．2％vs24．1％）（P〈0．05）。冷冻方法改进后的胚胎复苏率和全胚复苏率显著高于冷冻方法改进前（82．0％vs66．3％和50．0％vs27．5％）（P〈0．05）。结论胚胎质量与胚胎复苏率和临床妊娠率密切相关,冷冻胚胎解冻后全胚复苏率与临床妊娠率正相关,冷冻过程中的操作细节是胚胎实验室保证冻融胚胎复苏、移植成功的重要因素。     

不同时期和不同来源鼠胚玻璃化冷冻效果的比较

目的：比较不同时期、不同来源的鼠胚玻璃化冷冻的存活率以及发育为囊胚的成功率。方法：采用体外受精和体内受精的方式得到小鼠的2、4、8细胞期胚胎,对其进行玻璃化冷冻、解冻,观察胚胎的存活与囊胚形成,以未冷冻的胚胎作为对照组。结果：由体外受精和体内受精获得的2细胞期胚胎在冷冻复苏后的存活率分别为70.67%、72.06%,囊胚形成率分别为65.33%、67.62%;4细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为88%、89.71%,囊胚形成率分别为81.33%、83.82%;8细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为93.33%、94.12%,囊胚形成率分别为92%、94.12%。和对照组相比,2细胞和4细胞期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率差异有统计学意义（P＜0.05）,而8细胞期的胚胎差异无统计学意义（P>0.05）。不同时期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率间差异有统计学意义（P＜0.05）,受精方式对处于同一时期的胚胎在冷冻复苏后存活率和囊胚形成率均无明显影响。 结论：玻璃化冷冻可以作为小鼠胚胎保存的有效方法,相对2、4细胞期胚胎,冷冻效果最好的是8细胞期胚胎。     

不同成熟时期山羊卵母细胞冷冻保存研究

目的比较山羊卵母细胞在不同成熟时期解冻后体外成熟、体外受精及胚胎发育能力。方法收集山羊生殖泡（GV）期未成熟卵和成熟卵,分5组行开放式拉细麦管（OPS）法玻璃化冷冻,Ⅰ组：直接冷冻GV期卵;Ⅱ组：GV期卵在体外培养（IVC）8h后冷冻;Ⅲ组：GV期卵在IVC16h后冷冻;Ⅳ组：GV期卵体外培养成熟（IVM）后冷冻;Ⅴ组：直接冷冻体内成熟卵。解冻后比较各组卵受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率。结果Ⅰ组（GV期卵）冷冻解冻后存活率达56.8%,显著高于Ⅱ组（33.3%）、Ⅲ组（31.6%）、Ⅳ组（28.9%）及Ⅴ组（30.4%）,差异有高度统计学意义（均P〈0.01）。各组体外受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论采用OPS法玻璃化冷冻山羊GV期卵较冷冻其他成熟时期卵效果好。     

玻璃化冷冻方法三种冷冻载体冻存卵裂期胚胎效果的比较

目的应用冷冻环、冷冻膜和自制麦管片三种冷冻载体,采用玻璃化冷冻方法冻存昆明小鼠卵裂期胚胎,比较三种载体的冻存效果。方法采集通过体外受精在体外培养第2天得到的4-8细胞期的昆明小鼠胚胎247个,对其中177个按载体不同随机分为冷冻环组59个,冷冻膜组59个,自制麦管片组59个;剩余的新鲜胚胎70个作为对照组,比较冻融后鼠胚的复苏率和囊胚形成率。结果冷冻环组、冷冻膜组和自制麦管片组的胚胎复苏率分别为98.3%、98.3%和94.9%,三组比较差异无统计学意义（P〉0.05）;冷冻环组、冷冻膜组和自制麦管片组的囊胚形成率分别是84.5%、86.2%和82.1%,三组比较无统计学差异（P〉0.05）;新鲜对照组囊胚形成率为94.3%,与冷冻环组、冷冻膜组分别比较无统计学差异（P均〉0.05）,与自制麦管片组有统计学差异（P〈0.05）。结论采用玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵裂期胚胎,使用冷冻环和冷冻膜作为冷冻载体具有复苏率高、囊胚形成率高的优点,更适合应用于临床。     

洗胚对小鼠胚胎质量影响初探

本实验探讨了胚胎移植过程中洗胚对胚胎质量的影响。实验对象是KM鼠,对实验（不洗胚）组和对照（洗胚）组进行比较,结果显示实验组受体鼠产仔率为30.3%,对照组受体鼠产仔率为23.0%,实验组明显高于对照组,卡方检验P〈0.05,有统计学意义。从而得出移植过程中的洗胚对胚胎质量有一定影响的结论。     

卵母细胞体外成熟培养液的改良及研究

目的探讨卵母细胞体外成熟培养液的改良及研究。方法选取昆明小鼠50只作为研究对象,根据培养液的不同将50只小鼠分为A组和B组,每组各25只。A组采用低糖细胞培养基（DMEM）培养,B组采用含15％～20％胎牛血清的人类输卵管液培养,两组在相同条件下进行培养,比较两组的体外受精率、正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、可移植胚胎率、妊娠率及活产率。结果A组小鼠的体外受精率（71．4％）、正常受精率（65．7％）及卵裂率（89．1％）与B组（67．6％、68．1％、85．1％）比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;A组小鼠的优质胚胎率（31．7％）和可移植胚胎率（56．1％）均优于B组（25．0％、42．5％）,差异有统计学意义（X2=8．26、10．17,P〈0．05）。A组小鼠的妊娠率（23.3％）低于B组（32．6％）,差异有统计学意义（X2=7．58,P〈0．05）;但A组小鼠的活产率（17．8％）稍低于B组（18．9％）比较,差异无统计学意义（P〉O．05）。结论低糖DMEM培养液具有较好的应用效果,但仍需进一步的研奔．     

玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

目的：通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵（GV）、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵（IVM-MⅡ）,解冻复苏后,分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs 60.92%vs 69.93%,P〉0.05）。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%vs 96.19%,P〈0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P〈0.01）,且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs 31.34%,P〈0.01）。IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ冷冻组和对照组,差异均有显著性（28.57%vs 52.38%,P〈0.05;28.57%vs 57.14%,P〈0.01）。GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MⅡ冷冻组（53.85%vs 26.67%,P〈0.05）。IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组,差异均有显著性（P〈0.05,P〈0.01）。结论：GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟,其细胞骨架损伤较小,胚胎发育较好。     

胚胎因素对冷冻胚胎移植周期结局的影响

目的:探讨影响冷冻胚胎复苏率和移植成功率的胚胎因素。方法:回顾性分析149个冷冻胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)周期的临床资料,按胚胎发育时间、冷冻前胚胎质量、复苏后胚胎损伤情况分别进行分组,比较不同分类各组间的胚胎复苏情况和(或)临床妊娠率的差异。结果:受精第二天冷冻组与第三天冷冻组的胚胎复苏存活率和临床妊娠率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。冷冻胚胎中有优质胚胎者的种植率和临床妊娠率均显著高于无优质胚胎者(P<0.05)。全部移植完整存活胚胎和混合移植组的临床妊娠率和种植率均显著高于全部移植受损胚胎者(P<0.05)。结论:冷冻前胚胎质量和复苏后胚胎卵裂球损伤程度是影响临床妊娠率的重要因素。     

小鼠品系影响胚胎移植成功率的比较研究

目的:探讨不同受体鼠和供体鼠品系对胚胎移植成功率的影响以及不同品系胚胎混合移植的可行性. 方法:以Balb/c雄鼠和C57BL/6雌鼠杂交F1代(B6CF1)小鼠24只和昆明鼠(KM鼠)14只作为供体鼠,共取状态良好的受精卵362颗,分别或混合回种于8只B6CF1和16只KM受体鼠输卵管内,比较两种品系鼠的产仔率. 结果:除同品系回种可产仔外,KM鼠和B6CF1杂交鼠受精卵交叉回种B6CF1或KM受体鼠以及两品系受精卵混合回种均可产仔. 其中B6CF1受体鼠产仔率(29.0%)明显高于KM受体鼠(7.0%),B6CF1供体鼠产仔率(16.0%)也略高于KM供体鼠(11.0%);杂交B6CF1受精卵同品系回种产仔率最高(32.0%),KM鼠受精卵同品系回种产仔率仅4.0%,而B6CF1和KM鼠作为受体鼠混合回种两品系受精卵的产仔率分别为25.0%和15.0%. 结论:不同品系小鼠胚胎可交叉或混合回种,小鼠胚胎移植技术不受品系限制,但同品系胚胎移植成功率更高;B6CF1作为胚胎移植实验动物明显优于KM鼠.     

不同参数精子对卵胞质内单精子注射术结局的影响

目的 分析不同精子参数对卵胞质内单精子注射术（ICSI）临床结局的影响.方法 选取在我院接受ICSI治疗的不孕夫妇235对（共299个ICSI周期）,根据男方精液的来源和参数不同,我们将299个ICSI周期分为4组：精液正常组（A组,70例、96个周期）,严重少弱精子症组（B组,33例、44个周期）,附睾精子组（C组,23例、28个周期）和睾丸精子组（D组,109例、131周期）.比较4组的受精率、优质胚胎率、种植率和临床妊娠率等.结果 A组年龄明显大于其他3组（P〈0.01）.A、B、C、D组患者行ICSI卵数分别为937、476、344、1543,单周期移植胚胎数分别为2.74±0.49、2.22±0.47、2.07±0.26、2.12±0.43,A组单周期移植胚胎数显著多于其他各组（P〈0.01）.D组受精率（62.80%）显著低于其他3组（75.03%、72.06%、78.02%）（P〈0.01）.C组优质胚胎率（35.31%）显著低于其他3组{47.65%、48.40%、45.71%）（P〈0.01）,4组间临床妊娠率和种植率并无明显差异（P〉0.05）.结论 不同参数的精子虽然可以影响ICSI后胚胎早期的发育,但对临床妊娠率并无明显影响.     

改良拮抗剂方案促排卵治疗后冻融胚胎移植与新鲜胚胎移植的临床结局比较

【目的】探讨改良拮抗剂方案促排卵治疗后冻融胚胎移植的临床结局是否优于新鲜胚胎移植。【方法】回顾性分析本中心2012年6～9月采用改良拮抗剂方案促排卵后将全胚冷冻后再行冻融胚胎移植的患者（冻胚组,68例）与当周期行新胚移植（鲜胚组,82例）的临床结局。【结果】冻胚组胚胎着床率、临床妊娠率分别为43．38％、66．17％,较鲜胚组胚胎着床率（30．98％）、临床妊娠率（42．68％）明显升高（P〈0．05）,而其流产率（8．89％VS11．43％）和多胎妊娠率（31．1％VS34．3％）比较差异均无显著性（均P〉0．05）。【结论】改良拮抗剂方案促排卵治疗中将全胚冷冻保存后再行冻融胚胎移植可以大大地提高临床妊娠率。