CD4+ CD25+调节性T细胞AICD机制的研究

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞活化诱导的细胞死亡（AICD）发生的机制。方法CD4^＋CD25^＋T细胞以磁性细胞分离器（MACS）从BALB／c小鼠或DO11．10小鼠的静息T细胞分离纯化。体外细胞增殖抑制实验证实其免疫调节作用。CD4^＋CD25^＋T细胞的AICD以CD3／CD28单克隆抗体活化或以特异性OVA323-339肽、抗原提呈细胞活化等两种方法获得。CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡相关基因的表达通过实时定量PCR检测。流式细胞仪检测细胞的凋亡率。进一步观察FasL中和抗体、TRAIL中和抗体及caspase抑制剂zVAD-fmk对CD4^＋CD25^＋T细胞凋亡的影响。结果MACS成功分离CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，该细胞可特异性表达Foxp3基因，能明显抑制效应性T细胞的体外增殖。CD3／CD28抗体以及OVA特异性抗原活化8d的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞AICD达39％～45％。活化前后的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞死亡受体家族表达发生明显变化；FasL、TRAIL中和抗体及zVAD-fmk可明显抑制CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。结论FasL／Fas及其他凋亡相关分子可能参与了CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的凋亡。     

CD4+ CD25+调节性T细胞对树突状细胞的杀伤作用

目的 探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞是否对树突状细胞发挥免疫调节作用及其可能的机制。方法 用MACS（magnetic cell sorting）从BALB／c小鼠静息T细胞分离纯化CD4^＋CD25^＋T细胞，体外细胞增殖实验观察其对CD4^＋CD25^＋T细胞的免疫抑制作用；GM-CSF／IL-4培养自体小鼠骨髓来源DC，FACS（fluorescence-activated cell sorting）鉴定其表面分子特性；以CD3／CD28单克隆抗体活化CD4^＋CD25^＋调节性T细胞，FACS体外杀伤实验研究其对自体DC的调节作用，并观察穿孔素抑制剂EGTA对上述作用的影响。结果 用MACS法成功分离出CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，特异性表达而Faxp3基因，能明显抑制CD4^＋CD25^＋T细胞的体外增殖；骨髓来源的DC表达CDllc、MHCⅡ及少量协同刺激分子CD80、CD86；FACS体外杀伤实验证实以CD3／CD28抗体体外活化的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对自体DC有显著杀伤作用（P〈0．05），穿孔素抑制剂EGTA能部分抑制该杀伤效应（P〈0．05）。结论 CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可通过杀伤作用对自体DC发挥免疫调节作用，穿孔素／颗粒酶杀伤途径可能参与其中。     

CD4+CD25+调节性T细胞的生物学特性及功能

对自身抗原产生免疫耐受是防止发生自身免疫病的关键。自1995年日本学者Sakaguchi等首次报道CD4^＋CD25^＋调节性T（Treg）细胞以来，越来越多的研究证明这群T细胞在自身耐受的维持中发挥着重要的作用。CD4^＋CD25^＋调节性T细胞具有以下特点：①自身免疫防御作用；②自然条件下是处于无能（Anergy）状态；③抑制其他CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的生物活性；④抑制活性是抗原非特异性的；⑤抑制方法可能通过细胞与细胞间直接接触，或经分泌抑制性细胞因子发挥免疫抑制效应；     

环孢霉素A对OVA免疫TCR转基因DO11.10小鼠CD4+CD25+T细胞的影响

目的：研究免疫抑制剂Csh对处于免疫应答状态的小鼠脾脏调节性CD4^＋CD25^＋T细胞影响。方法：采用流式细胞术检测卵白蛋白（OVA）免疫的DO11．10小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋T细胞及其中Foxp 3^＋T细胞的变化。结果：OVA免疫后脾脏CD4^＋CD25^＋T细胞占CD4^＋T细胞百分数及Foxp 3^＋T细胞占CD4^＋CD25^＋T细胞百分数均增加，显示CsA可明显减少正常及免疫应答状态下小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋T细胞及CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋T细胞百分数。结论：CsA在抑制免疫应答的同时也可能抑制了免疫耐受的诱导。     

人CD4+CD25+调节性T细胞系的建立与功能分析

目的：建立可在体外长期培养的人CD4^ CD25^ 调节性T细胞系并研究其免疫生物学特性。方法：用流式分选的方法从健康人外周血淋巴细胞中得到CD4^ CD25^ T细胞，并对其进行体外长期培养、扩增；淋巴细胞转化实验分析其免疫抑制功能，流式细胞法分析其表型。结果：经对人CD4^ CD25^ T细胞的长期培养扩增，获得具有免疫抑制功能的调节性T细胞系。该T细胞系对经TCR的刺激不敏感，且能抑制同一来源或同种异型CD4^ CD25^ T细胞的活化，大剂量IL－2可以逆转其抑制功能。长期培养的CD4^ CD25^ T细胞，膜表面CD25和CTLA－4分子持续高表达，而CD4^ CD25^ T细胞CD25和CTLA－4分子的表达呈周期性变化。结论：将CD4^ CD25^ T细胞体外扩增培养成系，其功能和表型与同一来源的CD4^ CD25^ T细胞显著不同。     

介导CD4+CD25+调节性T细胞发育与功能的一个关键基因--Foxp3

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞是天然产生的调节性T细胞的重要亚群之一，在维持免疫系统稳态中发挥重要的作用。目前有关CD4^＋CD25^＋调节性T细胞分化发育的确切机制还不清楚。最近的研究发现Foxp3基因与CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分化发育和免疫调节功能的关系密切，进而提示Foxp3可能是CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的一个特征性标志。     

中国健康人外周血中具有CD4+CD25nt/hiCD127lo特征的调节性T细胞频率

目的：初步确定健康人外周血中具有CD4^＋ CD25^nt/hi CD127^lo特征的调节性T细胞（Treg）频率，为临床相关疾病的研究及Treg的分选提供参考。方法：采集312名8—60岁（5个年龄组）、不同性别健康人的静脉血，经三重免疫荧光染色，用流式细胞术分析CD4^＋ CD25^nt/hi CD127^lo Treg细胞频率，并观察细胞内Foxp3转录因子的表达。结果：健康人CD4^＋ CD25^nt/hi CD127^lo Treg细胞在外周血中约占CD4^＋ T细胞的（6．55±0．11）％，各年龄组之间有差异（P=0．015），组内性别之间也存在统计学意义（P〈0．05）； CD25^nt/hi CD127^lo细胞特异性地表达Foxp3转录因子。结论：初步确定了中国健康人外周血中具有CD4^＋ CD25^nt/hi CD127^lo表达特征的细胞频率，为Treg细胞的临床研究奠定了基础； CD25^nt/hi CD127^lo作为CD4^＋ CD25^＋ Treg细胞表面的特征性标志，可在分选时排除其他细胞干扰，获得较完整的Treg细胞。     

CD4+CD25+调节性T细胞及相关细胞因子的研究进展

胸腺来源的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）是机体维持自身免疫耐受的重要组成部分，约占CD4^＋T细胞的5％-10％。它具有免疫抑制及免疫无能的特性，是最重要的Treg细胞的亚群之一。近年发现CD4^＋CD25^＋Treg细胞主要通过分泌一些抑制性细胞因子和抑制自身反应性T细胞的免疫应答等方式在维持自身免疫耐受中扮演着重要的角色，其数量的缺乏或功能紊乱会导致各种自身免疫性疾病的发生。     

CD4+CD25+调节性T细胞抑制小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生

目的：研究CD4^ CD25^ Treg细胞对诱导小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)的影响。方法：磁性细胞分离器(MACS)分离CD4^ CD25^ T细胞，通过体外细胞增殖试验和IFN-γ的测定研究CD4^ CD25^ T细胞对CD4^ CD25^ T细胞的免疫抑制作用，同时通过过继转移试验研究CD4^ CD25^ T细胞抑制小鼠EAT的发生。结果：MACS分离的CD4^ CD25^ T细胞纯度可达到85％～94％，特异性表达FoxP3基因，体外能明显抑制效应性T细胞的增殖和IFN-γ的产生；将CD4^ CD25^ T细胞与病理性CD25^ T细胞共同注射正常小鼠，可抑制病理性T细胞诱导EAT的发生。结论：CD4^ CD25^ Treg细胞在体内外具有明显抑制效应性T细胞的功能。     

卵巢癌细胞培养上清诱导CD4+CD25-T细胞分化为CD4+CD25+调节性T细胞

目的研究卵巢癌细胞培养上清液是否能诱导外周血CD4^＋CD25^- T细胞转变为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。方法将外周血CD4^＋CD25^- T细胞分离后，对照组用CD3和CD28单抗活化，实验组在对照基础上加用卵巢癌细胞株SKOV3培养上清，72h后分离各组的CD25^＋和CD25^-T细胞，溴化脱氧尿嘧啶掺入标记法测定增殖能力及对静息的自体同源CD4^＋CD25^- T细胞的增殖抑制能力，流式细胞仪测定细胞糖皮质激素诱发型TNF受体（glucocorticoid-induced TNFR,GITR）与CTLA-4分子的表达，RT-PCR检测细胞卿mRNA的表达。结果与对照组相反，实验组的CD4^＋CD25^＋T细胞具有免疫抑制功能，自身增殖能力下降，GITR和CTLA-4分子的表达和CD4^＋CD25^＋调节性T细胞相似，并被诱导表达转录因子Foxp3 mRNA。结论卵巢癌细胞分泌的可溶性物质能诱导外周血CD4^＋CD25^-T细胞转化为CD4^＋CD25^＋调节性T细胞。     

CD4^＋CD25^＋T细胞：一类新被认识的免疫调节细胞

CD4^ CD25^ T细胞是最近才被认识的一类免疫调节细胞，在胸腺产生，主要发挥抑制性免疫调节功能，表达IL-10mRNA，细胞表面表达IL-2受体α链(CD25)，本身不产生IL-2，但在体内、外增殖需要外源性IL-2，在体外为无能细胞(anergy cell)，CD4^ CD25^ T细胞发挥免疫抑制作用是通过细胞-细胞接触依赖方式而非细胞因子依赖方式，CD4^ CD25^ T细胞在调控自身免疫性疾病的发生、炎症反应和T细胞稳态中发挥重要作用。本文拟对CD4^ CD25^ T细胞的生物学特性及其应用研究的最新进展作一综述。     

CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

目的：了解慢性粒细胞白血病慢性期（CML-CP）患者外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞中TCR Vβ亚家族T细胞的基因表达和克隆性.方法：利用RT-PCR分别扩增19例CML-CP患者外周血单个核细胞（PBMCs）、CD4^＋和CD8^＋细胞TCR Vβ亚家族基因的CDR3,阳性产物进一步经基因扫描分析其克隆性.结果：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞分别表达部分（1～21个）Vβ亚家族,均以Vβ13的表达率最高,其次为Vβ9,多数患者的一些Vβ亚家族T细胞呈克隆性增殖,主要出现于CD8^＋细胞中,分别以Vβ21（CD4^＋）和Vβ11（CD8^＋）亚家族的克隆性增殖多见.结论：CML患者外周血CD4^＋和CD8^＋细胞的TCR Vβ谱系均存在限制性分布,患者存在的克隆性增殖CD4^＋和CD8^＋T细胞可能与宿主抗CML抗原反应有关,它们可能在抗CML效应中起主要作用.     

胃肠肿瘤患者外周血树突状细胞功能失调与CD4+CD25+T细胞失衡的临床意义

目的：探讨胃肠肿瘤（GIC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）来源树突状细胞（DCs）和CD4^＋CD25^＋T细胞（Tregs）的免疫功能状态，以及其与肿瘤临床病理分期和手术的关系。方法：收集早期胃肠癌（Ⅰ／Ⅱ期）患者术前、术后第7天以及晚期癌（Ⅲ／Ⅳ期）患者外周血，以健康成人外周血为对照。提取单个核细胞（PBMCs），流式细胞术（FACS）分别检测Tregs占CD4^＋T细胞的比例。PBMCs经贴壁法分离提取DCs，经rhGM。CSF、rhIL-4体外扩增培养至第5天，获得未成熟DCs（imDCs），FACS检测表型；imDCs经rhTNF-α诱导培养至第7天，获得成熟DCs（mDCs），MTT法和ELISA法分别检测mDCs与自体T细胞混合培养时mDCs刺激T细胞增殖能力以及上清液中IFN-γ的含量。结果：晚期胃肠癌患者imDCs表型HIA-DR、CD80及CD86均显著低于健康成人和早期癌患者（P〈0．01）；早期胃肠癌术后第7天患者imDC8表型HIA-DR及CD86表达显著低于健康成人（P〈0．05）。晚期胃肠癌患者mDCs刺激自体T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力与健康成人相比均有所减弱（P=0．073，P=0．182）CD4^＋T细胞中Tregs的比例显著低于健康成人和早期癌患者（P〈0．001）；早期胃肠癌患者术后Tregs比例略低于术前（P=0．148）及健康成人（P=0．068）。HLA-DR、CD86表达与Tregs比例呈负相关性。结论：胃肠肿瘤患者尤其晚期和术后患者外周血DCs功能失调以及Tregs失衡可能和机体抗肿瘤细胞免疫耐受密切相关。     

转化生长因子-β参与CD4^＋CD25^＋调节性T细胞诱导的发育研究进展

CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋Treg）足一类具有免疫调节功能的淋巴细胞,在维持机体免疫耐受和免疫应答稳态方面发挥重要作用。转化生长因子β（TGF—β）与CD4^＋CD25^＋Treg的发育分化和功能有着密不可分的关系,虽然作用机理尚不完全明了,但其重要性毋情置疑。     

移植免疫耐受中调节性T细胞的研究进展

调节性T细胞（Tr）在诱导和维持移植免疫耐受过程中的作用越来越受到人们的重视。根据不同的细胞表型和功能已将Tr分为若干亚类，首先是胸腺内T细胞发育过程中自然产生的CD4^＋T细胞亚群，能够构成性表达IL-2受体的仅链（CD25）存在于外周，体内体外均可抑制效应性T细胞的增殖和功能；其次是产生于正常的免疫应答过程中的诱导性Tr亚群，包括Tr1和Th3通过分泌细胞因子如IL-10和TGF—β发挥抑制作用。除此之外，也有报道CD8^＋Tr、双阴性T（DNT）细胞和NKT细胞在移植耐受的不同模型中亦发挥重要作用。因而研究各种Tr亚群的生物学特征、调节机制及其在移植耐受中的作用非常必要。     

CD4+CD25+调节性T细胞与系统性红斑狼疮病情活动性关系的研究

目的：检测系统性红斑狼疮患者外周血CD4^＋CD25^＋、CD4^＋CD8^＋调节性T细胞亚群，探讨其与疾病活动性、肾脏损伤、血清抗ds-DNA抗体及免疫球蛋白和补体C3含量的关系。方法：采用流式细胞术检测北京协和医院住院和门诊SLE患者（n=37）外周血CD4^＋CD25^＋T、CD4^＋CD8^＋T细胞群比例，以15例RA和15例SS组成自身免疫性疾病对照，30例健康体检者作为正常对照，观察调节性T细胞亚群与SLE患者疾病活动性指标SLEDAI、IgG、C3及血清抗ds-DNA抗体的关系。结果：①疾病活动期SLE患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞群比例显著低于正常对照组（P〈0.01），疾病稳定期和风湿性疾病对照组与正常对照组结果差异无统计学意义。疾病活动期和稳定期SLE患者CD4＋CD8＋T细胞群比例都略高于正常对照组，但未发现结果差异有统计学意义（P〉0.05）。②疾病活动期SLE患者外周血CD4^＋CD25^＋T细胞比例及CD4^＋CD25^＋/CD4^＋值显著低于稳定期患者（P〈0.01）。SLE患者外周血CD4^＋CD25^＋/CD4^＋值与SLEDAI、补体C3呈低度相关（r分别为-0.491、0.368，P〈0.05），CD4^＋CD25^＋T细胞数量与SLEDAI呈负相关（r=-0.578，P〈0.05）。③SLE并发肾病组外周血CD4^＋CD25^＋T细胞群比例及CD4^＋CD25^＋/CD4^＋值显著低于非肾病组（P〈0.01；P〈0.05）。同一SLE患者治疗前后CD3^＋CD4^-CD8^-细胞和NK细胞降低，CD4^＋CD25^＋细胞、CD4^＋CD25^＋/CD4^＋值及CD8^＋T细胞增加，但未发现这些结果差异有统计学意义。本次研究未发现NK细胞、CD4^＋CD8＋T细胞、CD4^＋CD25^＋T细胞群比例在ds-DNA＋组与ds-DNA-组之间结果差异有统计学意义。结论：SLE患者外周血CD4^＋CD25^＋T细胞群比例与SLEDAI成负相关，与肾脏的损害也有密切关系，但与血清抗ds-DNA抗体产生的关系不明显。活动期SLE患者外周血CD4^＋CD25^＋T细胞减少，稳定期CD4^＋CD25^＋T细胞比例回升，因此推测CD4^＋CD25^＋T细胞的变化可能是导致疾病发生和病情发展及相关器官（如肾脏）损伤的关键环节之一。     

急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8~+ T细胞受体α和β链亚家族特点

目的:分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体α和β链亚家族特点。方法:从1例HLA*0201的急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细胞(PBMC),用乙肝抗原HBsAg表位S335-343多肽和细胞因子刺激PBMC以诱导CD8+ T增殖,用流式细胞仪分选出特异性CTL到96孔培养板,培养10～14 d后,提取细胞RNA,PolyA介导反转录,巢式PCR扩增TCR Vα和TCR Vβ,并用非特异性CD8+ T细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接测序和克隆测序分析。结果:从HBV急性肝炎患者分离的HBsAg335-343表位特异性CD8+ T细胞扩增出15个Vα亚家族和10个Vβ亚家族,其中用少量CTL仅检出Vα2、Vα9和TCR Vβ3、Vβ4、Vβ9,提示这几种亚家族可能为该特异性CTL TCR的优势取用亚家族,除Vα2呈现3种序列和Vβ9呈现2种序列外,其他亚家族内序列单一;而从患者非特异性CD8+ T对照细胞中可扩增到所有的32个TCRVα和25个Vβ亚家族,且同一亚家族序列呈现高度多样性。结论:急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体存在优势利用的特点,可能是由于针对同一抗原的特异性CD8+ T细胞克隆性增殖所致,其机制有待进一步分析。     

手足口病患儿T淋巴细胞亚群与CD3^＋CD4ˉCD8ˉ双阴性调节性T细胞的检测及其临床意义

目的探讨外周血T淋巴细胞亚群及CD3^＋CD4ˉCD8ˉ双阴性调节性T细胞在手足口病病人发病中的临床意义。方法采用流式细胞术检测了46例手足口病患者以及17例健康体检者外周血T细胞亚群CD3^＋、CD3^＋CD4ˉCD8^＋、CD3^＋CD4^＋CD8^＋、CD3^＋CD4^＋CD8ˉ与CD3^＋CD4ˉCD8ˉ双阴性调节性T细胞水平。结果与正常对照组相比,手足口病患者组CD3^＋、CD3^＋CD4ˉCD8’、CD3^＋CD4ˉCD8ˉ双阴性调节性T细胞的百分率降低（P值分别为0．008、0．050、0．025）。CD3^＋CD4^＋CD8^＋、CD3^＋CD4^＋CD8ˉ百分率以及CD4／CD8比值差异无统计学意义（P值分别为0．847、0．775、0．149）,以上各细胞亚群的百分率以及CD4／CD8比值在年龄与性别方面差异无统计学意义。结论手足口病患者CD3^＋CD4ˉCD8ˉ双阴性调节性T细胞、CD3^＋、CD3^＋CD4ˉCD8^＋异常变化提示其免疫功能异常。     

脱氢表雄酮对鼠成骨细胞及CD4+T细胞协同刺激分子表达的影响

目的探讨脱氢表雄酮（DHEA）对成骨细胞（osteoblasts，OB）及CD4^＋T细胞表达协同刺激分子的调控作用。方法颅骨酶解法培养鼠OB，体外模拟雌激素撤退；免疫磁珠细胞分选（rnagnetic cell soaing，MACS）法分离CD4^＋T细胞；将OB或CD4^＋T细胞分为对照组、E2及DHEA处理组，并以LPS刺激；以流式细胞术分析OB表面CD80、CD86以及CD4^＋T细胞表面CD28、CTLA-4的表达。结果经E2及DHEA处理后，OB表达CD80、CD86显著增加（P〈0．05，P〈0．01）；CSA可降低对照组及DHEA处理组OBCDS0、CD86的表达（P〈0．01）。除DHEA组CD28^＋T细胞百分比增加外（P〈0．05），其余各组CD4^＋T细胞CD28和CTLA-4的表达无显著改变（P〉0．05）。结论DHEA可上调鼠OB协同刺激分子CD80、CD86表达，该作用可被CsA阻滞；DHEA还上调CD4^＋T细胞CD28的表达，提示可改善骨．免疫调节网络。     

β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ在CD4+TH细胞中的表达及对其黏附能力的影响

目的研究β-1，4-半乳糖基转移酶I（β-1，4-galactosyltransferase I，β-1，4-GalT I）在CD4^＋TH中的表达与定位以及β-1，4-GalT I对CD4^＋ TH细胞黏附能力的影响。方法采用免疫磁珠阳性分选法分离纯化CD4^＋ TH细胞，通过RT-PCR、荧光免疫细胞化学法和激光共聚焦技术鉴定CD4^＋ TH细胞中β-1，4-GaIT I的表达与定位；分别用rhIL-2、rhIL-12、rhIL-4等细胞因子组合诱导CD4^＋ TH细胞活化分化，通过半定量RT-PCR、FCM检测CD4^＋ TH细胞中β-1，4-GaIT I的表达变化，运用层黏连蛋白结合实验比较CD4^＋ TH细胞黏附能力的改变；用α-乳清蛋白干扰CD4^＋ TH细胞表面β-1，4-GaIT I的活性及底物特异性，用层黏连蛋白结合实验分析其对CD4^＋ TH细胞黏附能力的影响。结果CD4^＋ TH细胞表面和细胞浆内表达长型和短型β-1，4-GalT I；rhIL-2活化的CD4^＋ TH细胞长型β-1，4-GaIT I mRNA水平及细胞膜表面β-1，4-GaIT I表达水平、细胞黏附能力均高于未经活化的CD4^＋ TH细胞，rhIL-2＋rhIL-12诱导培养的CD4^＋ TH细胞增强更明显；CD4^＋ TH细胞长型β-1，4-GaIT I mRNA水平及细胞膜表面β-1，4-GaIT I表达水平均与CD4^＋ TH细胞黏附能力呈正相关；α-乳清蛋白干扰后CD4^＋ TH细胞黏附能力降低。结论β-1，4-GalT I在CD4^＋ TH细胞中表达，且与细胞黏附能力密切相关，提示β-1，4-GalT I可能在CD4^＋ TH细胞的黏附过程中发挥重要作用。