多基原九里香药材的多重位点特异性PCR鉴别

目的 建立一种同时鉴别九里香药材两基原九里香Murraya exotica和千里香M. paniculata的DNA分子鉴别方法。方法 通过比较九里香、千里香的叶绿体基因组序列差异，根据叶绿体基因组上的单核苷酸多态性（SNP）变异位点分别设计九里香和千里香的特异性鉴别引物P03和P04，对影响聚合酶链式反应（PCR）结果的退火温度、循环次数、引物浓度比进行优化，建立了九里香和千里香的多重位点特异性PCR鉴别方法，并对影响该方法重复性的Taq酶种类、PCR仪型号进行耐受性考察和适用性考察。结果 在该多重位点特异性PCR鉴别方法中，当PCR反应循环数为31次，退火温度为60 ℃，九里香P03和千里香P04引物比为1∶2时，九里香可获得约330 bp的特异性条带，千里香可得到约230 bp的特异性条带，不同来源的九里香和千里香样品使用建立的多重位点特异性PCR鉴别方法均可获得一致结果。结论 该文建立一种快速、准确鉴别九里香药材基原的多重位点特异性PCR鉴别方法，可在单次鉴定操作中根据条带位置同时鉴别九里香和千里香。     

PCR-RFLP鉴别当归药材及饮片中掺混伪品——欧当归的方法

目的 该研究拟通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法（PCR-RFLP）建立一种能快速鉴别当归药材及饮片中掺伪欧当归的方法。方法 通过比对当归和欧当归的核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列酶切位点,选择欧当归的特异性酶切位点Fnu4HⅠ,并设计PCR-RFLP反应引物,对影响PCR-RFLP反应的退火温度、引物浓度、循环数和酶切时间等条件进行优化,并对该方法的准确性进行了考察。另外,利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对掺伪不同比例和不同来源的当归掺伪样品进行了适用性考察。结果 建立了当归药材及饮片中掺伪欧当归的PCR-RFLP鉴别方法,在退火温度63 ℃,循环数为30时,掺有欧当归的当归样品经过特异性引物扩增后,能被Fnu4HⅠ限制性内切酶酶切,在100~500 bp检出2条单一DNA条带,当归样品则无此条带。该方法对当归中掺入欧当归的检出限为3%,可用于日常当归中掺混欧当归的检测。结论 建立的PCR-RFLP鉴别方法能够灵敏、准确地检测当归药材及饮片中是否掺有欧当归,可为当归的质量控制提供检验依据,以保障其临床用药安全。     

蜈蚣配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量与临床疗效，建立蜈蚣配方颗粒特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴别方法。方法 根据蜈蚣细胞色素C氧化酶亚基3（COX-3）基因序列筛选适用于蜈蚣配方颗粒的稳定引物区间，并在区间内筛选获得蜈蚣及其混伪品的单核苷酸多态性（SNP）位点，设计特异性鉴别引物。分别收集蜈蚣及其混伪品，考察退火温度、循环次数、不同Taq酶、DNA模板量、不同PCR仪、不同引物量等因素对PCR鉴别方法的影响，建立并优化PCR反应体系，并对此方法的专属性及适用性进行考察验证。结果 PCR鉴别反应体系为2×M5 PCR Mix 12.5 μL，蜈蚣配方颗粒鉴别引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL，DNA模板2.5 μL，无菌双蒸水9.2 μL。PCR反应参数为94 ℃预变性3 min，循环反应30次（94 ℃变性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃延伸5 min。利用上述PCR反应体系和反应参数对蜈蚣药材及其制品进行扩增，电泳检测结果表明所有正品均可在约135 bp处显示出一条明亮条带，而混伪品无条带。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确对蜈蚣药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒中间体、配方颗粒成品进行准确鉴别，为进一步保障蜈蚣药材及其制品的质量具有重要意义。     

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别桃仁与苦杏仁

目的:对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究,建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法。方法:收集桃仁、苦杏仁样品,提取基因组总DNA,用ITS通用引物进行测序,通过Bio Edit软件进行序列比对,根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应,并对PCR反应条件进行了优化。结果:基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G4-7可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究,在位点特异性PCR反应条件考察中,25μL反应体系DNA模板用量适宜范围为0.05~1 ng,退火温度在59℃时特异性最佳,实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性。结论:该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,桃仁能够扩增出333 bp清晰条带,而苦杏仁没有该条带,从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别。     

烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性，建立烫水蛭（蚂蟥）及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据烫水蛭（蚂蟥）细胞色素C氧化酶Ⅰ（COⅠ）基因序列设计引物，筛选出烫水蛭（蚂蟥）的稳定引物区间；在区间内筛选获得烫水蛭（蚂蟥）的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，并设计烫水蛭（蚂蟥）特异性鉴别引物TSZ-F、TSZ-R；分别收集烫水蛭（蚂蟥）及其阴性样品，建立烫水蛭（蚂蟥）配方颗粒特异性PCR鉴别方法，并对PCR体系进行优化，对该方法的耐受性和适用性进行考察。结果 当退火温度为54 ℃、循环数为34次，烫水蛭（蚂蟥）及其配方颗粒经PCR和凝胶电泳后，可在约133 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带，伪品无条带。结论 建立的特异性PCR鉴别方法可准确鉴别烫水蛭（蚂蟥）饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒，也为可其中药配方颗粒的质量标准研究提供参考。     

蒙古黄芪、膜荚黄芪及混伪品种子的位点特异性PCR鉴别

目的 基于特异性聚合酶链式反应（PCR）建立一种可以准确、快速鉴别蒙古黄芪、膜荚黄芪种子的方法。方法 利用叶绿体基因组综合数据库（CGIR）及IdenDSS软件分别获取蒙古黄芪、膜荚黄芪的DNA特征片段，在此基础上筛选获得蒙古黄芪与膜荚黄芪的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据该位点设计蒙古黄芪特异性鉴别引物对MG-F/MG-R和膜荚黄芪特异性鉴别引物对MJ-F/MJ-R。分别建立蒙古黄芪和膜荚黄芪特异性PCR鉴别方法，优化PCR反应体系，并对该方法的专属性和适用性进行考察。结果 蒙古黄芪特异性PCR鉴别方法，采用引物对MG-F/MG-R、退火温度62 ℃、循环次数28次，经PCR扩增和凝胶电泳后蒙古黄芪在约220 bp处得到特异性条带，而膜荚黄芪和其他混伪品种子无条带；膜荚黄芪特异性PCR鉴别方法，采用引物对MJ-F/MJ-R、退火温度58 ℃、循环次数28次，经PCR扩增和凝胶电泳后膜荚黄芪扩增得到约150 bp的条带，而蒙古黄芪及混伪品无扩增产物。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法，可以准确、快速对蒙古黄芪、膜荚黄芪进行种源鉴别，为黄芪种子的分类与准确鉴定提供了一定的科学依据。     

地龙（参环毛蚓）配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的 为保障临床用药的安全性和有效性，建立地龙（参环毛蚓）药材及其加工制品混伪、掺假特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法。方法 根据地龙氧化酶亚基1（COⅠ）基因序列筛选出地龙配方颗粒的稳定引物区间，并根据区间内筛选获得地龙的特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计地龙特异性鉴别引物dlshmy-F及dlshmy-R，分别采集地龙及其混伪品，建立地龙配方颗粒特异性PCR鉴别方法并优化PCR反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。结果 退火温度为62 ℃，循环次数为36次，地龙及其配方颗粒经PCR反应及凝胶电泳后，可在约170 bp处观察到单一明亮的特异性鉴别条带，其他近源伪品如通俗环毛蚓、保宁腔蚓、栉盲环毛蚓等20种伪品及阴性对照均无条带。结论 该研究建立的特异性PCR鉴别方法可快速准确的鉴别出地龙药材、配方颗粒、冻干粉中的参环毛蚓源性成分，准确鉴定出全国广地龙中药材及饮片以及地龙的基原，也可为其他的中药配方颗粒质量标准研究提供了参考。     

蒿属外来药用资源中亚苦蒿的特异性PCR鉴别

目的 基于特异性聚合酶链式反应（PCR）建立了一种中亚苦蒿药材的鉴别方法，可以准确、便捷地鉴别中亚苦蒿及其近缘种。方法 利用Chloroplast Genome Information Resource（CGIR）数据库查找中亚苦蒿及其近源种叶绿体基因组序列，并筛选获得中亚苦蒿特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，根据SNP位点设计一对中亚苦蒿特异性鉴别引物zykh1-F和zykh1-R。采集中亚苦蒿及其常见近缘种的原植物样本，建立中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法并优化反应体系，对该方法进行耐受性和适用性考察。利用该方法对从新疆药材市场购买中亚苦蒿药材样本进行鉴别。结果 中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法采用鉴别引物zykh1-F和zykh1-R，退火温度为54 ℃、循环次数为33次。经PCR扩增和凝胶电泳后中亚苦蒿在210 bp处可观察到单一明亮条带，其余近缘种如艾、黄花蒿、白叶蒿、野艾蒿均无条带。结论 该研究所建立的中亚苦蒿特异性PCR鉴别方法可准确鉴别中亚苦蒿及其常见近缘种，具有高度特异性，且该方法节约时间和成本，为中亚苦蒿资源引种和利用提供一种方便快捷的物种鉴别方法。     

石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲PCR-RFLP鉴别方法研究

目的 通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法建立快速鉴别石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的方法。方法 对石菖蒲和藏菖蒲的核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列酶切位点进行比对分析，选择藏菖蒲的特异性酶切位点AluI，设计PCR-RFLP反应引物，对影响PCR-RFLP反应的退火温度、引物浓度、循环数、酶切时间等条件进行优化，对该方法的准确性进行考察。利用建立的PCR-RFLP鉴别方法对不同产地的石菖蒲、藏菖蒲及掺混样品进行适用性考察。结果 建立了石菖蒲药材及饮片掺混藏菖蒲的PCR-RFLP鉴别方法，在退火温度60℃、循环数为30时，藏菖蒲或掺有藏菖蒲的石菖蒲样品经过特异性引物扩增后，能被AluI酶酶切，在100～300 bp检出2条单一DNA条带，石菖蒲样品则无此条带。该方法能对石菖蒲药材及饮片中掺混的藏菖蒲进行准确鉴别，并对石菖蒲中掺入藏菖蒲的检出限为3%。结论 建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好、灵敏度高，可用于石菖蒲与藏菖蒲鉴别及石菖蒲中掺混藏菖蒲的检测，为石菖蒲与藏菖蒲药材的质量控制提供参考。     

白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究

目的: 筛选白术、苍术鉴别SNP位点,并设计特异性引物,实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法: 通过测序及GenBank中下载获得白术、苍术的psbA-trnH序列,通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点,设计位点特异性PCR引物,将ITS通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系,并优化PCR条件,对白术、苍术种子进行分子鉴定。结果: 构建了多重PCR鉴别体系,通过一个PCR反应,能扩增出苍术、白术约643 bp 的ITS DNA质控条带,扩增出白术172 bp的特异性鉴别条带,实现白术、苍术鉴别。结论: 使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别白术、苍术种子。     

炒苦杏仁饮片指纹图谱研究

目的:建立炒苦杏仁饮片的高效液相指纹图谱,提高药材质量控制水平.方法:采用高效液相色谱法,C18色谱柱,流动相乙腈-0.1％磷酸,流速1 mL· min -1,检测波长225 nm.采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”计算处理,确定了炒苦杏仁饮片指纹图谱研究方法.结果:各批次药材共获得10个共有峰,超过总面积95％,所得指纹图谱方法学考察结果良好,采用色谱指纹图谱相似度评价软件,对炒苦杏仁饮片指纹图谱进行相似度计算,其10批样品相似度在0.5 ～0.9.结论:指纹图谱的运用实现了炒苦杏仁饮片的全面和整体评价,能体现炒苦杏仁饮片的多个成分的指纹信息,为有效提高炒苦杏仁饮片质量控制提供参考.     

南北葶苈子的最新研究进展

葶苈子为十字花科植物播娘蒿Descurainia sophia或独行菜Lepidium apetalum的干燥成熟种子, 前者习称南葶苈子, 后者习称北葶苈子。中医理论认为其能泻肺平喘, 利水消肿, 用于痰涎壅滞、咳喘痰多、喘息不得卧及水肿、悬饮、小便不利等, 临床应用较广泛, 该文从本草考证、品种鉴别、炮制研究、化学成分、药理作用、含量分析、毒性等方面就南葶苈子与北葶苈子近年来的研究进展进行综述, 为其深入研究与开发提供参考。     

葶苈子、薏苡仁、车前子的利水功效比较

目的对比葶苈子、薏苡仁、车前子利水功效,并观察其作用机制异同点。方法代谢笼法考察葶苈子(2.34 g/kg)、薏苡仁(7.00 g/kg)、车前子(3.50 g/kg)的利尿作用,冰点降低法、酶法、离子选择电极法、ELISA法、Western blot法研究其利尿机制。结果葶苈子、薏苡仁、车前子显著增加水负荷大鼠给药7 h后的尿量(P0.05)以及降低水负荷大鼠给药7 h后的体质量(P0.05),且三者对尿肌酐(Ucr)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)无显著影响(P0.05)。葶苈子主要通过降低血清Na+、心钠素(ANP)、脑钠素(BNP)、肺中AQP3、肾脏AQP1与AQP2水平来发挥利尿作用;薏苡仁主要通过降低血清Na+、Cl-、ANP、肺中AQP3、胃中AQP3、肾脏AQP1与AQP2水平来发挥利尿作用;车前子主要通过降低血清Na+和Cl-、肺中AQP3、胃中AQP3、肾脏AQP1与AQP2水平来发挥利尿作用。结论 3味药材都具有显著的利尿效果,对肾脏无明显损害。主入肺经的葶苈子对利钠肽系统影响较大,主入脾经的薏苡仁对胃AQP3影响较大,主入肾经的车前子对钠氯转运以及肾脏AQPs影响较大。     

南北葶苈子的显微鉴别

目的进行南北葶苈子的鉴别研究为葶苈子药材的鉴定提供依据。方法采用肉眼或体式显微镜观察葶苈子性状特征;采用显微镜观察种子石蜡切片。结果北葶苈子扁卵形,较大,另端尖而微凹,具纵沟2条,其中1条较明显,表面具颗粒状突起;粘液层厚,纤维素柱较短;南葶苈子长圆形略扁,较小,另端较平截,表面具细密的网纹突起,粘液层薄,纤维素柱较长。结论研究发现的南北葶苈子的显微结构差异可作为南北葶苈子的鉴别特征。     

HPLC指纹图谱鉴别葶苈子与车前子

目的: 鉴别葶苈子与车前子. 方法: 采用高效液相色谱法建立南葶苈子指纹图谱,并使用相似度评价软件,系统聚类分析和偏最小二乘法判别分析对两者的HPLC图谱进行识别研究. 结果: 葶苈子与车前子的HPLC色谱峰和相对峰面积存在较大的差异,经统计分析,所有样品被分为葶苈子、车前子和混淆品三类. 结论: HPLC指纹图谱结合系统聚类分析和偏最小二乘法判别分析等化学计量学方法可用来鉴别葶苈子和车前子,该方法快速、简便、准确、有效,可为葶苈子和车前子的质量评价提供依据.     

大豆黄卷和淡豆豉的本草考证

目的:对以大豆为原料炮制的药材——大豆黄卷和淡豆豉进行本草考证,以期正本清源,确保临床用药安全有效。方法:通过梳理中国历代本草及医药典籍中大豆黄卷和淡豆豉的记载,分别从名称、炮制工艺、功效3个方面对其进行本草考证。结论:大豆黄卷的炮制原料和工艺均有较大变化,古代以黄豆、黑豆为炮制原料,现代主要以黄豆为主;古代炮制原料芽长至"13～16 cm"时干燥,而现代芽长至"0. 5～1 cm"后干燥。淡豆豉炮制原料古今并无差异,均使用黑豆,但在明清时期之前豆豉入药主要用咸豆豉,淡豆豉入药并非主流,到了明清时期才开始强调使用淡豆豉。大豆黄卷和淡豆豉的性味归经虽有古今差异,但功效主治仍未发生较大变化。     

车前子酚类成分的研究

目的研究车前子Plantaginis Semen中的酚类成分。方法车前子65%、95%乙醇提取物采用大孔树脂、硅胶、ODS、Sephadex LH-20、制备柱进行分离纯化,通过理化性质和波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离得到9个化合物,分别鉴定为(+)-(7R,7'R,8S,8'S)-新橄榄树脂素(1)、(+)-古柯愈创木基甘油-β-阿魏酸乙酯(2)、圣草酚(3)、木犀草素(4)、金圣草素(5)、羟基酪醇(6)、(E)-3,4-二羟基苯亚甲基丙酮(7)、阿魏酸(8)、5,7-二羟基色原酮(9)。结论化合物2~3、6~7、9为首次从车前属植物中分离得到,化合物5为首次从该植物中分离得到。     

南葶苈子及炒南葶苈子标准饮片的均匀化方法研究

[目的] 对南葶苈子及炒南葶苈子制备标准饮片的最佳均匀化工艺进行筛选。[方法] 以出粉率、黄酮类化合物的总含量（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖）、指纹图谱总峰面积作为指标设计L₉（3⁴）正交实验,对投料量、单次粉碎时间、粉碎次数3个因素进行考察,优化南葶苈子和炒南葶苈子制备标准饮片的均匀化方法。[结果] 南葶苈子最佳均匀化工艺：投料量150 g,单次粉碎时间10 s,粉碎4次;炒南葶苈子饮片最佳均匀化工艺：投料量100 g,单次粉碎时间10 s,粉碎3次。[结论] 通过正交实验得到的均匀化工艺方法得当,合理可行,为南葶苈子及炒南葶苈子制备标准饮片进行质量控制研究提供参考,为标准饮片均匀化技术规范制定提供了科学依据。     

精子异常症:治疗篇

众所周知，有47%的不育是由于精子异常引起的。尽管医学发展迅速，仍有40%的不育患者存在病因不明的精液异常使临床疗效受限。另一方面，有报道显示中医疗法治疗精索静脉曲张、前列腺炎和精子异常疗效满意。我们尝试通过盲法对照试验观察针灸对精子异常不育患者的精子浓度、形态和活力是否有改善作用。     

柏子仁生品及霜品中总皂苷的含量测定

目的:测定柏子仁生品及霜品中总皂苷含量.方法:通过比较不同的显色体系,采用正交设计优选出显色条件,建立了测定柏子仁总皂苷含量的分光光度法.结果:确定了香草醛-冰醋酸-硫酸显色体系,优选出显色的条件为80%(φ)硫酸,85℃水浴加热10 min.经测定柏子仁生品中总皂苷0.142%;霜品中总皂苷0.319%.结论:该方法稳定、简便、快速,适用于柏子仁总皂苷的含量测定.柏子仁炮制制霜前后总皂苷几乎没有损失.