TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌

目的利用实时荧光定量聚合酶链反应（实时PCR）方法进行肺炎链球茵的检测和流行病学调查。方法用实时PCR技术扩增并检测400例临床标本的肺炎链球菌的自溶素（1yt）基因,并将其与传统的培养法进行对比。结果400例,临床标本中,实时PCR检测肺炎链球菌为阳性的有78例（阳性率为18％）,传统培养法结果为阳性的有29例（阳性率为7．25％）。结论实时PCR是一种灵敏、特异、快速的检测肺炎链球菌方法,其可用于肺炎链球菌的诊断和流行病学调查。     

BOX-PCR技术在肺炎链球菌检测中应用

目的建立BOX-PCR方法 ,用于肺炎链球菌的检测和流行病学调查。方法用BOX-PCR技术扩增23株肺炎链球菌菌株,并应用50例临床标本检测,同时对方法的特异性、敏感性进行研究。结果对所测肺炎链球菌菌株均获得扩增产物,对其他非肺炎链球菌菌属无交叉反应,其检测敏感性可达101cfu/ml,50例临床标本BOX-PCR方法有9例检测出肺炎链球菌阳性(18.0%),而培养法阳性4例(8.0%)。结论 BOX-PCR方法能快速、特异、灵敏地检测肺炎链球菌和进行流行病学调查。     

环介导等温扩增检测肺炎链球菌方法的建立及临床应用

目的 建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测肺炎链球菌的方法.方法 根据美国国家生物信息中心(GenBank)上提交的肺炎链球菌R6株的lytA基因序列(登录号AF2)08540)设计特异LAMP引物,以盐酸胍一苯甲醇法提取阳性血培养瓶中细菌DNA,然后以LAMP技术扩增lytA基因,反应条件为63℃45 min,采用肉眼观察浊度和琼脂糖电泳的方法来观察结果.结果 在196份阳性血培养瓶中,采用LAMP法检测到肺炎链球菌16株,与传统方法比较,其检测肺炎链球菌的灵敏度和特异度均达到100%,且检测时间缩短为1 h左右.模拟标本的检测结果显示该方法的最低检测限为102CFU/ml.结论 该方法灵敏度高,特异性强,操作方便快速,适合从临床标本中检测肺炎链球菌.     

巢式聚合酶链式反应检测脑脊液标本中病原体的方法评价

目的探讨巢式聚合酶链式反应(PCR)检测脑脊液标本中病原体的可行性,为疾病的快速临床诊断提供参考。方法源自细菌16S rRNA基因序列设计的巢式PCR技术方法,包括2对引物,2次PCR扩增,第1对引物首次PCR扩增脑脊液标本提取的核酸DNA,第2对引物再次PCR扩增,其DNA模板为第1轮PCR扩增产物。将第2轮PCR扩增产物进行测序,对序列进行比对分析,从而确定感染的病原体。使用DNA微量分光光度测定布鲁氏菌纯菌核酸DNA,将DNA进行倍比稀释,用于巢式PCR敏感性测试。结果巢式PCR能够检测的最低限约为1个核酸DNA拷贝数。应用巢式PCR检测40份临床患者的脑脊液标本,扩增结果表明有37份标本获得约1 460 bp的预期扩增条带(不同细菌扩增片段有差异),测序比对结果显示,检出脑膜炎奈瑟菌7份、产碱假单胞菌1份、草假单胞菌22份、嗜麦芽窄食单胞菌2份、肺炎链球菌1份、未知细菌性病原体4份、未检出3份。结论巢式PCR能够快速检测与鉴定脑脊液标本中的细菌性病原体。     

脑膜炎患者脑脊液中细菌抗原的检测

作者以协同凝集试验(COA),乳胶凝集试验(LA)、对流免疫电泳(CIE)及鲎试验(LAL)四种方法检测脑膜炎患者脑脊液中细菌抗原,并比较其敏感性和特异性。作者采取的155例脑膜炎患者的脑脊液标本,细菌培养阳性的99例,作敏感性测定;细菌培养阴性的56例,作特异性鉴定。分别以COA、LA、CIE法检测β型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌及脑膜炎球菌培养阳性标本,发现测定流感嗜血杆菌抗原以COA及LA法敏感性较高(均为78%),CIE法略低     

昆明地区儿童脑脊液细菌培养阳性结果分析

目的 监测近年来昆明地区儿童细菌性脑膜炎(BM)病原菌分布特点。方法 对在2012年7月～2015年6月间,昆明医科大学附属儿童医院脑脊液细菌培养阳性结果进行统计,并结合患者的出院诊断及其它实验室相关检测资料进行回顾性分析。结果 4 627例合格的脑脊液培养标本中,阳性标本共计97例,阳性率为2.1%(97/4 627),其中首次检出细菌为91株(含污染菌17株)。前三位的病原菌依次为大肠埃希菌23株(31.1%)、肺炎链球菌15株(20.3%)和无乳链球菌7株(9.5%),三者共占检出病原菌的60.8%(45/74)。结论 大肠埃希菌、肺炎链球菌是主要病原菌。实验室应加强污染菌的鉴别以提高临床微生物学实验室服务质量。     

16S rDNA测序在儿童细菌性脑膜炎病原菌鉴定中的应用

目的探讨16S rDNA-PCR结合测序快速检测儿童细菌性脑膜炎病原菌的价值。方法收集2013年1月至2016年12月西安市儿童医院4 016例儿童脑脊液标本进行16S rDNA-PCR;测序阳性扩增产物并BLAST比对,与培养结果比较。结果 4 016例脑脊液标本16S rDNA-PCR阳性161例(阳性率4.0%),培养阳性104株(阳性率2.6%),二者比较差异具有统计学意义(χ~2=57,P0.05);从测序结果看,革兰阳性菌101株(62.7%),革兰阴性菌60株(37.3%);最常见的5种病原菌依次为表皮葡萄球菌41株(25.5%),肺炎链球菌22株(13.7%),大肠埃希菌21株(13.0%),流感嗜血杆菌15株(9.3%)和金黄色葡萄球菌13株(8.1%)。结论 16S rDNA-PCR结合测序能够很好地鉴定细菌性脑膜炎病原菌,比培养法检测时间更短、菌谱分布更宽,可作为一种新的检测方法和流行病学方法在临床应用;儿童细菌性脑膜炎病原菌以革兰阳性球菌为主。     

恒温扩增芯片法在下呼吸道病原体检测中的应用

目的评价恒温扩增芯片法在下呼吸道感染病原体检测中的效果。方法收集合格痰标本94例,通过恒温扩增芯片法和细菌培养法检测病原体,痰涂片抗酸染色、RNA恒温扩增,静脉血γ干扰素释放试验检测结核分枝杆菌。结果 42例标本通过恒温扩增芯片法检测到病原体,阳性率44.7%。主要病原体为流感嗜血杆菌(13株)、肺炎链球菌(10株)、铜绿假单胞菌(9株)、结核分枝杆菌(8株)、金黄色葡萄球菌(6株)、肺炎克雷伯菌(7株)、大肠埃希菌(4株)、嗜麦芽窄食单胞菌(4株)、鲍曼不动杆菌(1株)、衣原体(1株),未检测到肺炎支原体、嗜肺军团菌。结论恒温扩增芯片法操作简便、快速,可同时检测12种病原体并可筛选耐甲氧西林葡萄球菌的mecA基因。其对流感嗜血杆菌、肺炎链球菌检出率显著高于传统细菌培养法,对结核分枝杆菌的检测显著优于γ干扰素释放试验和涂片抗酸染色。该技术有利于下呼吸道感染的快速诊断和及时地针对性治疗。     

PCR-膜芯片检测痰结核杆菌耐药基因突变的应用研究

目的探讨PCR-膜芯片技术直接应用于痰标本中结核杆菌耐药基因突变检测的可行性。方法采集82例痰标本（结核患者64例,非结核患者18例）,TB膜芯片检测标本中的结核杆菌IS6110基因,阳性者利用12对特异性引物进行多重PCR,扩增产物与含有59个探针的耐药-TB膜芯片反向点杂交检测结核杆菌耐药基因突变,测序验证并与药敏试验比对。结果 TB膜芯片检测痰标本中的结核杆菌IS6110基因,特异度为100%（18/18）,灵敏度为81.3%（52/64）,阳性预测值为100%（52/52）,阴性预测值为60%（18/30）;在52例结核杆菌IS6110基因阳性的痰标本中,耐药-TB膜芯片检出INH基因突变的1例,RFP基因突变的1例,INH和RFP基因同时突变的2例,INH、RFP和SM基因同时突变的1例,其中4例结果与药敏及DNA测序结果基本符合,1例突变位点与测序一致,但细菌培养阴性。结论应用PCR-膜芯片技术可提高痰样中结核杆菌基因的检出率;耐药-TB膜芯片检测结果对临床耐药结核病的快速诊断具有重要的参考价值。     

细菌培养及实时定量PCR方法研究儿童脑膜炎病原菌分布

目的了解2005--2006年度我院中枢神经系统感染患儿脑脊液病原菌谱、血清型及耐药特点。方法脑脊液细菌鉴定采用细菌培养及实时定量PCR方法。肺炎链球菌血清分型采用荚膜肿胀试验，流感嗜血杆菌及脑膜炎奈瑟菌血清分型采用乳胶凝集法。抗菌药物敏感性试验采用K—B法及E试验。结果入组的新生儿患者28例，脑脊液细菌检测总阳性率39．3％，大肠埃希菌6例，占21．4％，居首位，其中4例ESBL阳性。其次是肺炎链球菌，占7．1％（2例）。未检测到脑膜炎奈瑟菌。1个月至11岁年龄组90例．细菌检测总阳性率33．3％，第1位是肺炎链球菌，占16．7％（15例），其中5例培养阳性，菌株血清型为19F型，2例对青霉素中介。其次是脑膜炎奈瑟菌，占5．6％（5例），3例培养阳性，2例为A群，1例为C群。结论2005--2006年，我院收治的不同年龄组脑膜炎患儿病原菌分布有所不同，新生儿患儿病原菌主要是大肠埃希菌，其次是肺炎链球菌。其他年龄组患小儿以肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌为主要病原菌。部分菌株已高度耐药。采用实时定量PCR方法可提高肺炎链球菌及脑膜炎奈瑟菌检测的阳性率。     

重组酶聚合酶扩增结合Cas12a输血相关病原体核酸检测方法的可行性

目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)结合Cas12a检测输血相关病原体的可行性。方法 1)根据输血相关病原体HIV、HBV、HCV基因组保守区设计、筛选相应Cas12a crRNA。2)据crRNA靶序列区叠瓦状设计RPA巢式扩增内、外侧引物,凝胶电泳法和荧光探针法筛选巢式RPA内、外侧引物。3)通过质粒或病毒模拟标本梯度稀释,将含不同拷贝数或含量的靶序列RPA扩增,扩增产物以Cas12a检测评价RPA结合Cas12a的检测下限。4)用HIV、HBV、HCV相应近源病毒HTLV、WMHBV、HGBV的同源序列的重组质粒来评价所选crRNA的特异性。结果建立起RPA结合Cas12a核酸检测系统,16份重组质粒的检测下限为10 cp,8份EcoHIV病毒模拟标本的检测下限为1 fg,HIV、HBV、HCV 3种重组质粒及RPA扩增产物的交叉检测间未出现错误检出;10例HIV阳性确证标本的检测结果均为阳性。结论 RPA结合Cas12a检测HIV、HBV、HCV核酸是1种检出限和特异性均较好的核酸检测方法。     

实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测肺炎支原体

目的 建立一种快速、灵敏、特异的肺炎支原体实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)检测方法,以期用于临床肺炎支原体感染检测。 方法 通过测序分析和序列比对,选取肺炎支原体p1基因中保守区域设计特异性引物和荧光探针,建立和完善此real-time PCR检测方法,并进行扩增效率、灵敏度及特异度评价。与已报道的肺炎支原体常规聚合酶链反应(PCR)方法进行150份临床标本检测能力比较。 结果 建立的real-time PCR方法对肺炎支原体的检测限约为10 cfu。使用该方法对9株肺炎支原体ATCC标准株和30株临床分离株核酸扩增均为阳性;对10种其他支原体、13种常见呼吸道病原菌染色体及人类染色体扩增结果均为阴性。同时,临床标本的检测结果显示该方法检测灵敏度优于常规PCR。 结论 本研究建立的real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测标本中肺炎支原体核酸,可适用于临床肺炎支原体诊断。     

实时荧光定量聚合酶链反应技术在结核性脑膜炎中的诊断价值

目的 用涂片、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测结核分枝杆菌,探讨其临床应用价值.方法 对临床确诊的结核性脑膜炎(n =110)、可疑结核性脑膜炎(n=205)和非结核性脑膜炎(n=100)患者的脑脊液标本分别采用涂片、RT-PCR两种方法进行检测,对结果进行对比分析.结果 415例脑脊液标本中,脑脊液涂片检查阳性率为2.4％(10/415),PCR检测阳性率为12.5％(52/415);脑脊液涂片、PCR法检测110例临床确诊的结核性脑膜炎患者脑脊液标本阳性率分别为6.4％(7/110)、26.4％(29/110);检测205例临床可疑结核性脑膜炎患者脑脊液标本阳性率分别为1.5％(3/205)、11.2％(23/205).比较两种方法的阳性检测率,差异有统计学意义(P＜0.05),检测100例非结核患者脑脊液标本,涂片及PCR检测均为阴性.结论 RT-PCR法检测脑脊液中TB-DNA对结核性脑膜炎的诊断有决定意义,具有较高临床应用价值.     

双色荧光原位杂交技术检测乳腺癌石蜡切片人类表皮生长因子受体2基因扩增

目的:应用荧光原位杂交技术检测乳腺癌组织人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)基因扩增情况.并对操作方法进行优化.方法:收集2008年4月至2008年10月期间我院乳甲科进行手术治疗的乳腺癌患者的癌组织病理切片,采用荧光原位杂交(FISH)技术检测Her-2基因扩增情况,并与免疫组化结果相比较,分析两者的相关性,同时优化操作方法.结果:收集的40例乳腺癌石蜡切片中,免疫组化检测Her-2蛋白表达(+++)有6例,(++)有22例,(+)有7例,(-)有5例.其中Her-2蛋白表达(+++)的标本FISH检测结果均为阳性,基因扩增与蛋白表达的符合率为100%;Her-2蛋白表达(++)的标本FISH结果有6例阳性,16例阴性,基因扩增与蛋白表达的符合率为27.3%.Her-2蛋白表达(+)及(-)的标本FISH结果均为阴性.Her-2蛋白表达(++)及以上的标本基因扩增与蛋白表达的符合率达到42.9%(r=0.584,P＜0.01).结论:FISH检测乳腺癌Her-2基因扩增的结果与IHC检测的蛋白表达结果符合率较好,可作为乳腺癌Her-2基因检测的一项新技术;在具体操作时,应注意严格控制切片厚度、消化时间及变性杂交温度等因素.     

重组聚合酶等温扩增-侧流层析试纸条检测技术在诊断病原微生物中的应用研究进展

重组聚合酶等温扩增(RPA)技术是新开发的具有高灵敏度、高特异性的等温扩增技术, 将RPA与侧流层析试纸条检测(LFS)技术相结合, 可快速鉴别目的基因。迄今为止, RPA-LFS技术已广泛运用于医药、食品、植物学等领域。本文将对RPA-LFS技术在病原微生物中的诊断进行综述, 为实现病原微生物的即时诊断提供参考。     

感染性心内膜炎患者的主要病原菌耐药基因检测

目的分析感染性心内膜炎患者耐药表型与耐药基因的关系。方法收集感染性心内膜炎患者血培养分离的草绿色链球菌和葡萄球菌,提取DNA,用聚合酶链反应(PCR)法扩增检测耐药基因。结果草绿色链球菌扩增的基因为PBP1a、PBP2b和PBP2x,这3个基因主导β-内酰胺类抗菌药物耐药,葡萄球菌扩增基因为mecA和ermB,mecA基因可引起耐甲氧西林阳性,ermB基因主导大环内酯类耐药,该实验选取的5株草绿色链球菌未检测出PBP1a、PBP2b和PBP2x基因,葡萄球检测检测结果显示6、7、8、10号菌株mecA基因阳性,6、7、8、9号菌株ermB基因阳性。结论耐药基因检测可以对临床感染性心内膜炎患者早期用药起到指导作用。     

咽拭子和肛拭子标本核酸检测对新型冠状病毒肺炎检测效果的比较

目的分析咽拭子和肛拭子标本核酸检测对新型冠状病毒肺炎检测效果的应用价值。方法选取2020年3月至2021年1月安阳地区医院收治的新型冠状病毒肺炎患者82例,收集患者咽拭子标本、肛拭子标本,均行核酸检测。比较不同标本的检出率,同一患者、同一时间、不同标本检测结果,咽拭子检出患者病毒核酸扩增循环阈值(Ct值)情况变化。结果肛拭子阳性检出率(24.39%,40/164)较咽拭子阳性检出率(38.41%,63/164)低,差异有统计学意义(χ^(2)=7.487,P<0.05)。同一患者、同一时间肛拭子阳性检出率(17.07%,28/82)较咽拭子(9.76%,16/82)高(χ^(2)=4.473,P<0.05)。检出组ORFlab基因、N基因与未检出组比较,差异未见统计学意义(P>0.05)。结论咽拭子和肛拭子标本核酸检测对新型冠状病毒肺炎病毒核酸扩增Ct值无明显影响,咽拭子阳性率高,但同一患者同一时间肛拭子阳性率高,临床可结合实际情况联合应用两种检测方法,以提高检验结果准确性。     

细菌性肺炎快速诊断基因芯片的初步构建

目的：根据细菌16 S rRNA基因特点设计常见病原菌的特异性探针,采用酶显色技术构建基因芯片,探讨其临床应用的可能性。方法选取肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及铜绿假单胞菌等8种细菌性肺炎常见的病原菌的标准菌株作为研究对象,并选择12份患者的痰液标本进行检测。在16 S rRNA基因保守区设计 PCR反应的通用引物及革兰阳性菌、革兰阴性菌的通用探针,利用可变区的差异设计合成特异性探针,构建基因芯片。利用细菌16S rRNA基因设计的PCR通用引物进行扩增,所有8种细菌均获得350 bp的扩增产物。以地高辛标记特异性探针,构建完成可用于8种常见病原菌检测的基因芯片,结果8种标准菌株基因芯片检测均取得了预期效果,对12份痰标本中常规培养阳性7份,其对应芯片检测结果均成阳性,5份常规培养阴性的标本中,芯片结果提示阳性的有3份,其中1份为嗜肺军团菌,2份为使用抗生素后的患者标本。结论设计合成的 PCR通用引物对扩增细菌的16 S rRNA基因具有较高的特异性及灵敏度。构建的基因芯片可用于常见细菌性肺炎病原菌的检测鉴定,且对抗生素使用后的临床标本及苛养菌有一定的诊断价值。本研究所获得基因芯片对于细菌性肺炎的检测具有简单、快速、特异性及敏感性高的特点。     

脑膜炎患儿脑脊液和血液中的细菌定量及其诊断意义

儿童的急性细菌性脑膜炎是死亡和幸存者严重神经损害的重要原因。脑脊液(CSF)培养物的镜检和抗生素敏感性试验是诊断和治疗这种感染的基础。在影响镜检结果的各项参数中,最有意义的是体液中微生物的浓度,但CSF中微生物浓度同镜检关系的资料不多。因此,本研究旨在(i)测定儿科脑膜炎患者CSF中微生物的数量;(ii)评价CSF中细菌浓度同镜检结果的关系;(iii)阐明CSF中细菌计数和菌血症发病率是否有联系。材料与方法标本来源和标本的处理:被检标本来自16个月