浙江宁海卫氏并殖吸虫种群变异的研究

目的进一步了解浙江宁海卫氏并殖吸虫遗传背景。方法对宁海小汀、宁海西溪(冷风洞)和宁海余山卫氏并殖吸虫不同种群进行核糖体DNA第二间区(ITS2)和线粒体细胞色素C氧化酶亚单位(CO1)基因序列分析研究。结果浙江宁海三地卫氏并殖吸虫ITS2序列有363个碱基对,肺型肺吸虫和非肺型肺吸虫ITS2序列完全相同,与泰国种群(AF159604,Nakorn Nayok省)核酸同源性为97.5%,两者差异有显著意义。浙江宁海小汀和宁海余山二地卫氏并殖吸虫CO1序列有390个碱基对,其中3个核酸位点不同(No.49,178,331);浙江宁海小汀种群与中国闽清种群(U97209)和泰国种群(U97212)核酸同源性分别为99.5%和89.0%。结论浙江宁海卫氏并殖吸虫属亚洲东北组群。     

云南省绿春县并殖吸虫的初步调查

2006年分别选择云南省绿春县的大兴、戈奎和牛孔等3个乡镇的山涧溪流中捕获溪蟹69只，用研磨水洗沉淀法分离并殖吸虫囊蚴。仅在牛孔乡的景洪溪蟹（Potamon chinghungense）体内检获并殖吸虫后尾蚴，溪蟹的感染率为27.6%（8/29），未检获囊蚴，平均每蟹感染后尾蚴2.25条。经形态学鉴定为丰宫并殖吸虫（Paragonimus proliferus）的后尾蚴。首次证实云南省绿春县为丰宫并殖吸虫的分布区。     

豫皖闽浙4省溪蟹并殖吸虫囊蚴核糖体ITS2和线粒体CO1基因序列分析

目的分析我国豫皖闽浙4省5地区溪蟹并殖吸虫囊蚴核糖体内转录间隔区2 (ITS2)和线粒体细胞色素c氧化酶亚基I (CO1)基因序列,鉴定并殖吸虫囊蚴虫种。方法 2018年10月至2019年9月,于安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县、河南省济源市邵原镇、福建省政和县及漳州市等5个调查点采集溪蟹,分离溪蟹中并殖吸虫,提取囊蚴基因组DNA,PCR扩增核糖体ITS2和线粒体C01基因,测序。采用DNA Star拼接各基因测序结果,并进行各序列间的比对,同时与GenBankTM中并殖吸虫基因进行BLAST比对。基于ITS2、CO1序列,以肝片吸虫为外群,采用邻接法构建系统进化树。结果安徽省休宁县蓝田镇、浙江省永嘉县、河南省济源市邵原镇、福建省政和县及漳州市等5个调查点的溪蟹并殖吸虫囊蚴阳性率分别为82%(49/60)、41%(29/70)、55%(41/74)、65%(41/63)和45%(32/71)。ITS2、CO1扩增长度依次约为500 bp、450 bp。安徽省休宁县蓝田镇和浙江省永嘉县溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1与卫氏并殖吸虫(KC417492.1,AF219379.2)的相似性最高,分别为99%~100%、96%~99%,均与卫氏并殖吸虫聚为一支;河南省济源市邵原镇溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2、CO1与斯氏并殖吸虫(KX129924.1、MK568551.1)的相似性最高,分别为98%~100%、95%~99%,均与斯氏并殖吸虫聚为一支;福建省政和县溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2与斯氏并殖吸虫(KX129924.1)的相似性最高,为98%~100%,与斯氏、宫崎并殖吸虫聚为一大支(两虫种分支不明显),CO1与宫崎并殖吸虫(AY618823.1、AY618834.1)的相似性最高,为91%~94%,与宫崎并殖吸虫聚为一支,与斯氏并殖吸虫分支明显;福建省漳州市溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2与卫氏并殖吸虫(KC417492.1)的相似性最高,达100%,CO1与三平正并殖吸虫(AF159595.1)的相似性最高,为97%~99%,与三平正并殖吸虫聚为一支。结论 4省5地区溪蟹并殖吸虫囊蚴PCR扩增检出CO1与卫氏、斯氏、宫崎和三平正并殖吸虫高度同源。并殖吸虫CO1可作为并殖吸虫虫种鉴别的潜在分子标记。     

广西融水县并殖吸虫虫种的分子鉴别

用分子生物学方法鉴定广西融水县大小两种并殖吸虫囊蚴感染动物后所获成虫的虫种。在广西融水县采集溪蟹分离获得大小两种囊蚴 ,感染大鼠后获成虫 ,曾从形态上鉴定为斯氏狸殖吸虫和巨睾并殖吸虫。但用酚 -氯仿法抽提成虫基因组DNA ,PCR扩增第二内转录间隔区 (ITS2 )基因后测序 ,用Blast程序与GenBank中的斯氏狸殖吸虫、巨睾并殖吸虫等的ITS2基因序列进行同源性检索 ,用PrimerPremier软件比较其基因差异 ,用Phylip软件的Neighbor程序绘制其基因进化树后 ,测得大小囊蚴感染所获成虫的ITS2基因片段分别为 4 37bp、4 33bp ,两者的基因同源性为 10 0 % ,与斯氏狸殖吸虫的基因同源性分别为 10 0 %、99% ,与巨睾并殖吸虫的基因同源性分别为 91%、92 % ;基因序列差异比较 ,大小囊蚴感染所获成虫与斯氏狸殖吸虫的基因序列差异为 0 ,而与巨睾并殖吸虫存在明显差异 ;绘制基因进化树 ,大小囊蚴感染所获成虫与斯氏狸殖吸虫在同一分支同一位置 ,与巨睾并殖吸虫亲缘关系较远。融水县大小囊蚴感染所获成虫与斯氏狸殖吸虫为同一物种 ,小囊蚴感染所获成虫并非巨睾并殖吸虫。     

广东省部分地区卫氏并殖吸虫分布与DNA序列分析

目的 调查广东省卫氏并殖吸虫分布现状。方法 解剖采集自广东省从化市良口、 龙门县南昆山、 乐昌市大洞和平远县木溪与郭屋等5个调查点山溪的螺蛳及溪蟹, 检查卫氏并殖吸虫尾蚴、 囊蚴。以所获囊蚴人工感染家猫、 犬, 解剖查找并殖吸虫成虫。取成虫样本, 进行线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I基因 （COI基因） 和核糖体基因第二间隔区 （ITS2 基因） 基因序列分析, 并与GenBank中现存并殖吸虫的COI、 ITS2基因序列进行比对。结果 良口、 南昆山、 大洞、 木溪和郭屋5处疫源地的第一中间宿主螺蛳鉴定均为放逸短沟蜷, 其尾蚴感染率分别为0.33%、 0.15%、 0.058%、 0.10%和0.05%; 第二中间宿主溪蟹鉴定均为平和华溪蟹, 其囊蚴感染率分别为100%、 100%、 38.09%、 55.36%和65.26%。良口、 南昆山、 大洞、 木溪和郭屋平均每只蟹检出囊蚴数量分别为79.4、 105.66、 9.16、 16.18个和15.6个, 平均每克蟹含囊蚴数量分别为11.12、 7.87、 0.58、 0.69个及0.85个, 囊蚴鉴定均为卫氏并殖吸虫。人工感染家猫、 犬体内检获卫氏并殖吸虫成虫与虫卵。良口、 南昆山、 大洞、 木溪和郭屋5处调查点卫氏并殖吸虫成虫样本COI基因序列与GenBank中的AF219379.21、 AF540958.1号基因序列同源性分别为99%、 99%、 99%、 98%、 99%, ITS2基因序列与DQ836243.1、 DQ351845.1、 AB354217.1号同种基因同源性分别为98%、 99%、 98%、 98%、 98%。结论 广东省新发现2处卫氏并殖吸虫超高度疫源地和3处卫氏并殖吸虫高度疫源地, 5 地虫种间无明显差异。     

重组酶介导的斯氏并殖吸虫等温扩增荧光检测方法的建立及检测效果初步评价

目的　建立一种基于重组酶介导的等温扩增（recombinase⁃aided isothermal amplification, RAA）技术的斯氏并殖吸虫快速核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法　从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,提取基因组DNA进行分子鉴定。以斯氏并殖吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因（cytochrome c oxidase 1, cox1）基因序列作为靶序列设计、制备、筛选引物及探针。以河南省济源市和洛阳市宜阳县斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA检测方法验证。以含斯氏并殖吸虫cox1基因序列的不同浓度重组质粒和斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;应用建立的荧光RAA法同时检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、华支睾吸虫和日本血吸虫基因组DNA,评价其检测特异性。结果　从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,经分子鉴定和系统进化分析确认其与GenBank中并殖吸虫标准株基因序列具有同源性。成功建立了斯氏并殖吸虫荧光RAA检测方法,可在5 min内扩增到河南省济源市和洛阳市宜阳县采集的斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA,而阴性对照无扩增。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低检出限为10 拷贝/µL重组质粒,且均在5 min内出现阳性扩增;以基因组DNA为模板,可检测到的最低模板DNA浓度为10 pg/µL,且均在10 ~ 15 min内出现阳性扩增。荧光RAA法检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、日本血吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论　成功建立了一种基于荧光RAA技术的快速、敏感、特异的斯氏并殖吸虫核酸检测方法,在斯氏并殖吸虫病流行区溪蟹现场快速检测与虫种鉴定中具有潜在应用价值。     

应用多重PCR技术鉴定我国6个旋毛虫地理株的研究

目的 对我国猪源旋毛虫地理株进行鉴定和分类。 方法 根据旋毛虫rDNA扩展片段V区（expansion segment V region,ESV）和内转录间隔区（internal transcribed spacers,ITS）ITS1和ITS2基因序列合成5对特异性引物,以旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）、乡土旋毛虫（T. nativa,T2）、布氏旋毛虫（T. britovi,T3）、伪旋毛虫（T. pseudospiralis,T4）及纳氏旋毛虫（T. nelsoni,T7）的国际参考株作为对照,应用多重PCR对我国6个猪源旋毛虫地理株（河南、云南、哈尔滨、黑龙江同江、湖北及天津）进行鉴定,并观察影响多重PCR扩增的因素。 结果 我国6个猪源旋毛虫地理株多重PCR扩增结果显示,均具1条与T1相同的条带（173 bp）。应用多重PCR对单条旋毛虫幼虫、不同保存条件的旋毛虫幼虫及含幼虫的新鲜小鼠肌肉提取液进行扩增,均得到173 bp的特异性条带。 结论 经多重PCR鉴定我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1。     

浙江宁海并殖吸虫中间宿主感染情况调查

2007年8月在宁海县深圳区俞山村现场捕捉溪蟹和川卷螺,镜检并殖吸虫囊蚴和尾蚴的感染情况。共捕获97只长江华溪蟹（Sinopotamon yangtsekiense）,阳性率为11.3%(11/97),平均感染度为1个囊蚴/只。其中, 体重＜5 g的20只, 阳性率为10%(2/20), 平均感染度为1个囊蚴/只; 体重>5 g的77只中,5～15 g的阳性率为10.2%（5/49）,平均感染度为1个囊蚴/只;15～25 g的阳性率为20.0%（4/20）, 平均感染度为1个囊蚴/只,25～35 g的阳性率为0（0/8）。体重>5 g的77只中,雄蟹与雌蟹比例为2.5 ∶ 1,阳性率分别为12.7%（7/55）和9.1%（2/22）,差异无统计学意义（χ²=1.20,P>0.05）。采集放逸短沟蜷（Semisulcospira libertina）200只,未发现阳性。     

多重PCR技术检测恶性疟原虫抗药性相关分子标志的方法研究

目的 建立恶性疟原虫5个主要抗药性相关基因的单管多重PCR扩增方法，用于恶性疟原虫抗药性分子标志检测。 方法 依据各基因参考序列，运用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件，设计5对特异性引物，采用Hot Start Taq DNA聚合酶，设置递增延伸温度，对恶性疟原虫标准株（3D7、Dd2和HB3）、分离株（FCC1/HN、 CMH/YN）、现场标本（来源于海南、 云南和缅甸）、 近缘虫种对照（间日疟原虫、 伯氏疟原虫、 食蟹猴疟原虫、 杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫）和空白对照（以H2O为模板）进行5个抗药性相关基因（包括恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因Pfcrt、多药抗性基因Pfmdr1、二氢喋酸合成酶基因Pfdhps、二氢叶酸还原酶基因Pfdhfr和三磷酸腺苷酶第6亚基基因PfATPase6）的单管多重PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，测定扩增产物序列，并与参考序列（3D7株）比对。 结果 经电泳，恶性疟原虫标准株、分离株和现场标本的多重PCR扩增产物均可见5条目标条带。测序结果与参考序列比对，高度同源，最低同源性为98.5%。模板DNA量达0.1 ng即满足扩增要求，近缘虫种对照和空白对照未见扩增产物。 结论 多重PCR技术实现了单管1次反应完成5个抗药性相关基因的扩增，该方法灵敏，特异性好，有助于提高恶性疟原虫抗药性分子标志的检测效率。     

粤北山区并殖吸虫流行分布现状初步研究

摘要： 目的 了解粤北地区并殖吸虫流行分布现状。 方法 采集并解剖每处调查点山溪中螺蛳及溪蟹,查找并殖吸虫尾蚴和囊蚴。以所获囊蚴人工感染猫、犬,解剖猫、犬查找并殖吸虫成虫。取成虫样本,与GenBank里并殖吸虫的COI基因与ITS2基因序列比对,进行基因序列分析。 结果 里东、叟里元、下洞河、太坪和小坑5处调查点溪蟹三平正并殖吸虫囊蚴感染率分别为74.54﹪ (41/53)、68.91﹪ (32/47)、77.77﹪(24/32) 、76.92﹪ (40/52)和81.5% (22/27),溪蟹物种均鉴定为平和华溪蟹。与GenBank三平正并殖吸虫基因序列比对,5处成虫样本COI基因同源性分别为99.5% 、100% 、99.5% 、99.5% 和100%,ITS2基因同源性为100%。大洞调查点的螺蛳检出并殖吸虫短尾尾蚴,感染率为0.058% （1/1,700）,螺蛳物种鉴定为放逸短沟蜷,溪蟹检出卫氏并殖吸虫囊蚴,感染率为38.09﹪ (32/84),溪蟹物种亦鉴定为平和华溪蟹。大洞成虫样本COI基因与卫氏并殖吸虫同源性100%,ITS2基因与卫氏并殖吸虫同源性99.5%。 结论 粤北地区新发现三平正并殖吸虫高度疫源地5处,第二中间宿主为平和华溪蟹。5处疫源地虫种间无差异。卫氏并殖吸虫高度疫源地1处,第一中间宿主为放逸短沟蜷,第二中间宿主为平和华溪蟹。 关键词：并殖吸虫 ;尾蚴 ; 囊蚴 ;感染率 ; 放逸短沟蜷 ;平和华溪蟹     

并殖吸虫的分类研究进展

长期以来并殖吸虫的分类定种是以形态学特征为依据的,随着分子生物学技术的发展,ITS2和CO I基因的DNA序列分析在并殖吸虫分类的应用,使原来在形态上难以区分的虫种得以鉴别,澄清了并殖吸虫分类中长期存在的一些争议问题,使并殖吸虫的分类更加客观合理,为并殖吸虫及并殖吸虫病的深入研究奠定重要的基础.该文对并殖吸虫的种属关系以及虫种的分类地位进行了综述.     

福建北部地区斯氏并殖吸虫疫源地宿主感染情况分析

目的考察福建北部地区斯氏并殖吸虫中间宿主螺、蟹种群及其孳生地,比较生态环境改变前后感染率,并分析其变化原因。方法 2009-2019年,以并殖吸虫病例为线索,对福建省北部南平市的建瓯市小桥镇涤上村、东峰镇桂林村、城关镇七里街村和建阳区崇雒乡上洋村、政和县东平镇西表村、岭腰乡前溪村以及三明市的三元区居阳村等11处调查点进行现场采集螺、蟹,并考察其生态环境,设框(33 mm2)检测螺分布密度,计算螺的并殖吸虫尾蚴感染率和蟹的并殖吸虫囊蚴感染率、感染度。囊蚴采用人工感染健康犬(2只)和PCR扩增内转录间隔区2 (ITS2)序列、线粒体细胞色素氧化酶1 (CO1)基因进行鉴定。考察原孳生地生态环境的变化,复查螺、蟹的感染率、感染度,分析环境变化对感染率的影响。结果 11处调查点查见唐氏拟小豆螺、建瓯拟小豆螺和小桥拟钉螺等3种螺。山涧水源小沟或渗水湿地等微型生态环境为螺的适宜孳生地,螺多栖息于沟内水线上下5 mm的潮湿环境,主要附着于沟内潮湿的陈旧落叶、枯枝,其次为石块上,泥砂中较少。唐氏拟小豆螺、建瓯拟小豆螺和小桥拟钉螺的平均分布密度分别为156/框、179~291/框和12~266/框;各调查点均有螺查出斯氏并殖吸虫尾蚴,唐氏拟小豆螺、建瓯拟小豆螺和小桥拟钉螺的感染率分别为0.22%(4/1 851)、0.38%(36/9 420)、1.10%(102/9 247)。11处调查点查见福建华溪蟹、福建博特溪蟹、角肢华南溪蟹和待定种华南溪蟹等4种溪蟹。溪蟹多栖息于水流缓慢的山涧,白天潜伏于石块下,夜间四出觅食。溪蟹的斯氏并殖吸虫囊蚴感染率为38.99%~96.77%,平均感染率为80.21%(231/288),平均感染度为19.8个囊蚴/蟹。PCR结果显示,囊蚴样品扩增出的ITS2序列约500 bp,与GenBank中斯氏并殖吸虫相似性为99%;CO1基因序列约450 bp,与GenBank中宫崎并殖吸虫相似性为100%。人工感染实验结果显示,2只感染犬解剖后分别获得6和8条成虫,经鉴定均为斯氏并殖吸虫。孳生地环境改变有山洪暴发、垦植、干旱和人为破坏等原因,孳生地环境改变后对11处19次复查中,有10次未采集到螺,有5次未采集到蟹。5个调查点孳生地环境变化为山洪暴发所致,灾后进行7次调查均未查见螺,其中3处未查见溪蟹。11处调查点孳生地环境改变后,蟹的斯氏并殖吸虫囊蚴感染率为36.11%(91/252),平均感染度为4.9个囊蚴/蟹。孳生地环境改变前后的感染率差异具统计学意义(P<0.05)。结论福建北部建瓯等地为斯氏并殖吸虫高度感染的自然疫源地。孳生地生态环境改变后螺、蟹斯氏并殖吸虫尾蚴/囊蚴感染率下降明显,其中山洪暴发和垦植等是影响螺、蟹感染率下降的主要因素。     

Paragonimus heterotremus Chen and Hsia (1964), in Vietnam: a molecular identification and relationships of isolates from different hosts and geographical origins

Paragonimus heterotremus Chen and Hsia (1964), and paragonimiasis caused by this species is a newly detected disease in Vietnam. Twelve samples of Paragonimus (Platyhelminthes: Trematoda: Digenea: Paragonimidae) from different life-stages (eggs, miracidia, metacercariae, adults from natural and experimental hosts) and host species (crab, dog, cat and human) were collected in different geographical locations in Vietnam. DNA sequences were obtained from each for partial mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) (387 bp) and the entire second ribosomal internal transcribed spacer (ITS-2) (361 bp). The ITS-2 sequences were identical among all specimens, including those previously reported in GenBank. For cox1, there were sequence differences between specimens from Vietnam (four provinces, different locations) and those from Guangxi (China) and Saraburi (Thailand). Phylogenetic trees inferred from cox1 and ITS-2 sequences using sequence data for 15 P. heterotremus and for other Paragonimus spp. revealed that all P. heterotremus originating from Vietnam, Thailand and China form a distinct group. This information also confirms the identity of the Vietnamese specimens as P. heterotremus.     

间日疟原虫裂殖子表面蛋白的等位基因型检测

目的　建立一种间日疟原虫裂殖子表面蛋白 1(PvMSP-1)基因型检测技术。　方法　设计针对PvMSP 1ICB5～ICB6多态区的引物进行PCR ,其产物用PvuⅡ内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测 ,鉴别我国间日疟原虫现场分离株基因型。　结果　 98份间日疟血样经套式PCR扩增均出现大小约为 40 0bp(Belem型 )或 470bp(Sal-1型 )的特异性片段。酶切消化后 ,45份 470bp样本出现 12 0bp和 3 5 0bp酶切片段 ,为Sal-1型 ;40份 40 0bp的样本中 3份仅出现 1条 40 0bp片段 ,为Belem型 ;3 5份出现 12 0bp和 2 80bp两种酶切片段 ,为Ⅲ重组型 ;2份 12 0bp和 2 40bp片段 ,为朝鲜型。结论　套式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 (PCR-RFLP)技术可用于检测我国间日疟原虫的 3种PvMSP-1等位基因型。     

广州北部山区并殖吸虫流行分布现状初步研究

目的调查广州北部山区并殖吸虫流行分布现状。方法采集并解剖调查点山溪中螺蛳、溪蟹,检查并 殖吸虫尾蚴、囊蚴。用所获囊蚴人工感染猫、犬,解剖猫、犬查找并殖吸虫成虫。取成虫样本,进行COI 基因、ITS2基因序列分析,与GenBank检索并殖吸虫,COI基因与ITS2基因序列相比较。结果良口螺蛳尾蚴 感染率0.32%（4/1 210）,螺种为放逸短沟蜷。溪蟹囊蚴感染率100%（35/35）。感染度：79.4个囊蚴/只 蟹,11.12个囊蚴/g蟹,最高只蟹检出囊蚴1 050个,蟹种平和华溪蟹。南昆山螺蛳尾蚴感染率0.15%（3/2 000）,螺种为放逸短沟蜷。溪蟹囊蚴感染率 100%(59/59),感染度：105.66个/只蟹,7.87个/ g蟹。蟹 种为平和华溪蟹。吕田螺蛳尾蚴感染率0.03%（1/310）,螺蛳种为拟钉螺。溪蟹囊蚴感染率36.73% (36/98),感染度4.55个囊蚴/只蟹,0.53个囊蚴/ g蟹,蟹种为平远南海溪蟹。良口和南昆山成虫COI、 ITS2基因DNA序列与GenBank检索卫氏并殖吸虫COI、ITS2基因序列相比较：同源性分别为99%、98%和98%、 97% 。结论广州北部山区新发现卫氏并殖吸虫超高度疫源地两处,两疫源地虫种无差异。斯氏狸殖吸虫中 度疫源地一处。     

卫氏并殖吸虫致病品系PCR-RAPD分子标记的初步研究

目的探讨卫氏并殖吸虫致病品系PCR-RAPD分子标记。方法应用随机扩增多态DNA(PCR-RAPD)技术,对浙江宁海小汀、宁海西溪、遂昌、临安等地卫氏并殖吸虫囊蚴进行遗传变异研究。结果通过8条寡核苷酸随机引物扩增,B17-1600bp为浙江宁海小汀肺吸虫种群特异性DNA片段,A9-680bp为浙江宁海西溪,遂昌、临安三地肺吸虫种群共有特异性DNA片段。结论结果提示B17-1600bp,A9-680bp可作为卫氏并殖吸虫不同致病品系的分子标记。