凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

目的:提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率,增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性.方法:通过两次PCR,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3.将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点,构建成凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3,将该质粒分别以限制性内切酶BamHI和XhohI进行酶切鉴定,将初步鉴定显示可能克隆有目的基因的质粒进行测序鉴定.结果:测序结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Noteborn报告的凋亡素基因序列一致,同源性为l 00%.在其起始密码子前添加了Ko zak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE.结论:采用两次PCR法可提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端,并构建成凋亡素真核表达载体.     

凋亡素原核表达载体的构建和表达

目的 构建凋亡素原核表达系统，以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 通过PCR方法，以pcDNA-VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达栽体pET-DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后，聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38300的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达栽体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

双基因（VP3、IL-18）联合致小鼠骨肉瘤S-180细胞凋亡的效应

目的探讨VP3、IL-18双基因抑制骨肉瘤S-180的联合抑瘤作用。方法将VP3、IL-18基因插入pVAX1表达载体的pCMV启动子之下的EcoRI位点，构建成pVVP3及pVVp3-IL18。将该重组质粒与单独表达凋亡素基因的重组质粒分别注射荷S-180肿瘤细胞的BALB／C小鼠，比较抑瘤趋势和抑瘤率。结果联合应用VP3基因和IL-18基因的重组病毒治疗组的抑瘤率（46．16％）高于单独应用VP3基因组的抑瘤率（19．56％），两组比较有统计学差异（P〈0．05）。结论凋亡素基因具有凋亡诱导效应及体内的抑瘤效应。凋亡素基因VP3与IL-18基因有协同抑瘤效应，联合基因治疗骨肉瘤可提高抑瘤效果。     

受控凋亡素基因逆转录病毒载体诱导人肝癌细胞凋亡

目的:构建受控重组凋亡素基因逆转录病毒载体,观察受四环素调控的凋亡素基因的表达对人肝癌细胞的影响。方法:构建重组逆转录病毒表达载体pRevTRE—VP3。调节载体pRevTet-Off和表达载体pRevTRE—VP3分别转染PT67包装细胞后,取其病毒上清液依次感染人肝癌细胞系HepG2,以四环素调控凋亡素基因在HepG2/Off-VP3细胞中的表达,以流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:重组逆转录病毒载体pRevTRE—VP3构建成功;经PCR和RT—PCR证实凋亡素基因在HepG2细胞中得到了表达;HepG2/Off-VP3—8细胞在无四环素培养环境中凋亡率明显高于在1μg/ml四环素环境中的细胞凋亡率(P＜0．05)。结论:凋亡素基因经RevTet系统导入人肝癌细胞HepG2后,可在四环素调控下表达凋亡素并诱导HepG2细胞凋亡。     

分泌型PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡

目的研究分泌型的含蛋白质转导结构域的凋亡素(PTD4-Apoptin)融合基因经人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达和分泌后,对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响,探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法构建PTD4-Apop-tin融合基因的pSecTag2分泌型真核表达载体,并采用脂质体介导将其转染入HUVEC细胞,Western blot检测PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及分泌,转染48h后收集培养上清作为条件培养液,用于HepG2、L02细胞培养,共培养24h后,采用Western blot检测细胞内和核内Apoptin的含量,流式细胞术检测细胞凋亡。结果瞬时转染pSecTag2-PTD4-Apoptin的HUVEC细胞可表达及分泌PTD4-Apoptin融合蛋白,其培养上清中的PTD4-Apoptin融合蛋白可有效进入HepG2和L02细胞,并可在HepG2细胞核内聚积,显著诱导HepG2细胞凋亡达47.4%(P<0.001),而对L02细胞无此效应。结论 HUVEC细胞表达分泌的PTD4-Apoptin融合蛋白可显著诱导邻近HepG2细胞凋亡,而对L02正常肝细胞无损伤。     

凋亡素基因对人结肠癌细胞作用的研究

目的探讨凋亡素基因的导人对人结肠癌细胞的影响。方法将凋亡素基因VP3克隆人真核表达载体pEGFP-C2，构建成重组质粒pEGFP-VP3。用脂质体转染法将pEGFP-C2和pEGFP—VP3分组分别转染人类结肠癌细胞（Lovo）和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3），通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在不同组细胞中的定位、表达及细胞的生长、凋亡情况，MTT法测定不同组细胞的生长曲线，并用AnnexinV—FITC流式细胞技术检测细胞的凋亡率。结果在Lovo／EGFP组和3T3／EGFP—VP3组细胞中，EGFP均匀分布于细胞中，细胞形态无明显变化，细胞凋亡率较非转染细胞组亦无明显增加。而在Lovo／EGFP-VP3组细胞中，EGFP-VP3以荧光颗粒形式集中在细胞核，并逐渐变粗，最后细胞碎裂成片状，流式细胞技术检测Lov0／EGFP-VP3组的细胞凋亡率明显高于其他对照组（P〈0．01）。结论pEGFP-VP3可诱导人类结肠癌细胞凋亡。     

凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

目的 构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体，为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率，增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法 通过两次PCR，以pcDNA-VP3质粒为模板．扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3。将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点，构建重组凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3，将该重组表达载体分别以限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切鉴定，进一步将初步鉴定显示插入目的基因的质粒进行测序鉴定。结果 测序结果表明，本研究合成的凋亡素基因与Notebom报告的凋亡素基因序列一致，同源性为100％。在其起始密码子前添加了Kozak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE。结论 采用两次PCR法可将提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端，并构建成凋亡素真核表达载体。     

携带凋亡素基因的重组腺病毒对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299凋亡的影响

目的:研究携带凋亡素基因VP3的重组腺病毒载体Adxsi-GFP-VP3对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299的凋亡的影响。方法:取对数生长期SK-MES-1、NCI-H1299细胞,各分为重组腺病毒(Adxsi-GFP-VP3)组、空病毒(Adxsi-GFP)组和细胞对照(磷酸盐缓冲液)组,依次记为A、B、C组。采用逆转录-聚合酶链反应和Western blot法检测A、B组细胞转染48、72 h的VP3 mRNA和Apoptin表达情况,透射电镜观察A组细胞转染72 h的超微结构变化。采用MTT法检测3组细胞转染24、48、72、96 h的细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞转染后24、48、72 h的凋亡率及细胞周期变化。结果:与B组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞转染48 h后有VP3 mRNA表达,转染72 h后有Apoptin表达。A组转染72 h后SK-MES-1、NCI-H1299细胞均出现细胞凋亡的超微结构改变。与B、C组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞增殖活性降低、细胞凋亡率增加,且与转染时间呈正相关;转染72 h S期的SK-MES-1、NCI-H1299细胞比例降低、G2/M期细胞比例增加。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:Adxsi-GFP-VP3能有效诱导SK-MES-1、NCI-H1299细胞凋亡。     

氨基末端激酶信号通路在Apoptin基因诱导Hela细胞凋亡中的作用

目的:探讨肿瘤特异性凋亡基因(Apoptin gene)在诱导Hela细胞凋亡时,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路在细胞发生凋亡中的作用.方法:用含有肿瘤特异性凋亡(Apoptin)基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的Hela;采用流式细胞仪、免疫印迹法(Western blot)、苔盼蓝染色法及RT-PCR等方法研究其在不同时间条件下Hela细胞诱导凋亡的作用.结果:Apopin基因瞬间转染的Hela细胞可出现明显的细胞凋亡;而且凋亡细胞的数量与Apoptin的转染时间有关;凋亡细胞内磷酸化型JNK蛋白随凋亡细胞数量的增加而增多,而非磷酸化型JNK蛋白表达无明显变化.结论:Apoptin基因具有诱导Hela细胞凋亡的作用JNK信号通路的激活可能在Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡过程中发挥作用.     

Induction of insolubility by herpes simplex virus VP22 precludes intercellular trafficking of N-terminal Apoptin-VP22 fusion proteins

The herpes simplex virus protein VP22 has the intriguing ability to deliver proteins from an expressing cell to neighboring cells. Fusion of VP22 to Apoptin, a protein that induces apoptosis in tumor cells but not in normal cells, might enhance the delivery of Apoptin. To analyze this hypothesis two fusion proteins of VP22 and full-length Apoptin were constructed, namely VP22-VP3 and VP3-VP22, and their apoptosis-inducing ability and intercellular spreading behavior were analyzed by transfection in tumor cells. While both of the Apoptin-VP22 fusion proteins retained the capacity to kill tumor cells, neither of them showed intercellular trafficking. To determine whether the presence of a nuclear localization signal in the C-terminus of Apoptin caused nuclear retention of the fusion protein and the subsequent lack of intercellular spreading, VP22 was fused to the biologically active N-terminal part (residues 1–69) of Apoptin (VP3n), which lacks the nuclear localization signal. However, analysis of the VP3n-VP22 fusion constructs gave no evidence of intercellular transport. A more careful inspection of different fractions of cell lysates expressing Apoptin with or without fusion to VP22 revealed that both the full-length Apoptin protein and its fusion with VP22 are insoluble. Despite the fact that VP3n was found to be soluble on its own, which could make it amenable to transport by VP22, the VP3n-VP22 fusion proteins were present exclusively in the insoluble fraction. We hypothesize that the N-terminal multimerization domain of Apoptin cooperates with VP22 to facilitate aggregation with cellular proteins, thereby inducing insolubility. From these results we conclude that, depending on the fusion partner, VP22 can have a negative effect on the solubility of fusion proteins, which consequently precludes intercellular trafficking. Such properties should be taken into account when establishing new VP22-mediated protein transduction systems.Abbreviations CAV Chicken anemia virus - DAPI 2,4-Diamidino-2-phenylindole - GFP Green fluorescent protein - NLS Nuclear localization signal