DNA聚合酶θ对乳腺癌细胞株MCF-7放射敏感性的影响

目的 观察DNA聚合酶θ(POLQ)对人类乳腺癌细胞株MCF-7放射敏感性的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot法检测siRNA转染前后POLQ表达率的变化;利用噻唑蓝(MTT)比色法、平板克隆形成实验、流式细胞术对不同实验组进行分析.结果 POLQ-siRNA组细胞POLQ mRNA和POLQ蛋白表达量分别是空白对照组的(12.16±0.56)％和(32.01±0.65)％ (P＜0.01).转染后72 h,POLQ-siRNA组、空白对照组细胞吸光度(A)值分别为(0.76±0.02)和(0.81 ±0.02),POLQ-siRNA 组细胞增殖能力明显低于空白对照组(P＜0.01);平板克隆形成实验分析结果显示POLQ-siRNA组放射增敏比(SER)为1.24(＞1),表明转染POLQ-siRNA后MCF-7细胞放射敏感性显著增强.结论 抑制POLQ表达可以显著提高MCF-7细胞对放射的敏感性.     

相关成纤维细胞自噬调控对乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化影响

目的 研究报道,乳腺癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)在乳腺癌的侵袭、转移中起到促进作用,而机制未明.本研究探讨乳腺癌CAFs自噬调控对MCF-7细胞EMT进程的影响.方法 采用胶原酶消化法对CAFs及配对人乳腺癌正常成纤维细胞(NBFs)进行原代培养,采用免疫荧光和蛋白质印迹法进行鉴定;建立CAFs和NBFs与MCF-7条件培养基(CM)共培养及Transwell小室共培养模型,共分为3组进行实验,空白组即MCF-7单独培养组(CON),对照组即正常乳腺癌成纤维细胞与MCF-7共培组(NBFs),实验组即乳腺癌相关成纤维细胞与MCF-7共培养组(CAFs).Transwell侵袭及迁移实验检测各组MCF-7细胞侵袭和迁移能力.蛋白印迹法检测各组MCF-7细胞EMT上皮标志分子E-cadherin蛋白和间质标志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表达情况;蛋白质印迹法检测CAFs与NBFs自噬相关蛋白LC3B、Beclin1和p62表达差异;自噬抑制剂3MA处理CAFs后蛋白质印迹法检测CAFs上述自噬相关蛋白表达差异;予以自噬抑制剂3MA预处理CAFs后,收集CM与MCF-7共培养,分3组进行实验,空白组即MCF-7单独培养组(CON);对照组即MCF-7与CAFs-CM共培养组(CAFs-CM);实验组即MCF-7与3MA-CAFs-CM共培养组(3MA-CAFs-CM).蛋白质印迹法检测各组MCF-7细胞EMT上皮标志分子E-cadherin蛋白和间质标志分子N-cadherin和Vimentin蛋白表达情况.结果 通过酶消化法原代培养可获取α-SMA(+)、Vimentin(+)E-cadherin(-)具有CAFs典型特征的肌成纤维细胞;Transwell侵袭、迁移实验证实CAFs可促进MCF-7细胞侵袭、迁移;蛋白质印迹法检测显示,CAFs组MCF-7 E-cadherin蛋白表达量为0.432±0.012,比NBFs组的0.585±0.02及空白组的0.659±0.016表达水平低,F=120.098,P<0.05.而CAFs组间质蛋白标志物Vimentin蛋白表达量为0.309±0.065,比NBFs组的0.103±0.011及空白组的0.062±0.009表达低,F=42.395,P均<0.05.CAFs组N-cadherin蛋白表达量为1.439±0.07比BNFs组的1.3347±0.028及空白组的1.176±0.021表达低,F=22.578,P<0.05,提示CAFs促进MCF-7发生EMT;CAFs细胞的Beclin1蛋白表达量为2.950±1.261,高于NBFs的0.862±0.727,t=-3.21,P<0.05;CAFs细胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值为2.937±0.194,高于NBFs的2.314±0.224,t=-3.638,P<0.05;而CAFs p62蛋白表达量为0.342±0.093,低于NBFs的0.750±0.021,t=7.432,P<0.05,提示CAFs自噬水平高于NBFs.予以自噬抑制剂3MA处理CAFs后,处理组CAFs细胞的Beclin1蛋白表达量为0.211±0.008,低于未处理组的0.266±0.009,t=8.094,P<0.05;处理组CAFs细胞的LC3BⅡ/LC3BⅠ灰度值比值为0.496±0.004,低于未处理组的0.618±0.022,t=9.312,P<0.05;而处理组的p62蛋白表达量为0.307±0.043,高于未处理组的0.143±0.008,t=-6.471,P<0.05,说明3MA可以抑制CAFs自噬水平.自噬调控后共培养,各组E-cadherin蛋白表达有统计学意义,F=44.157,P<0.05;与对照组MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达量1.209±0.010相比,CAFs-CM组的1.062±0.027表达下调,而3MA-CAFs-CM组MCF-7细胞E-cadherin蛋白表达量为1.104±0.019,较CAFs-CM组表达上调,均P<0.05;3组MCF-7细胞Vimentin和N-cadherin表达差异有统计学意义,P<0.05.结论 CAFs能够促进MCF-7发生EMT并增强其侵袭转移能力,而抑制CAFs自噬后,其诱导的MCF-7发生EMT进程受到抑制.     

血清HIF-1α、组织P53表达水平对乳腺癌预后意义

目的探讨血清缺氧诱导因子-1（HIF-1）和组织P53的表达水平与乳腺癌预后的关系。方法悬浮芯片法检测117例乳腺原发浸润性导管癌、10例复发乳腺浸润性导管癌、20例乳腺良性肿瘤和31例正常人血清中HIF-1含量,并利用免疫组织化学检测其组织中P53蛋白的表达。结果原发、复发乳腺癌血清HIF-1和P53蛋白表达水平明显高于良性肿瘤和正常对照组（P〈0.01）,复发癌高于原发癌（P〈0.05）;血清HIF-1和组织P53蛋白水平在不同的病理学特征中差异有显著性（P〈0.05）;乳腺癌患者的HIF-1与P53表达水平呈正相关（r=0.544,=0.000）。结论血清HIF-1参与了乳腺浸润性导管癌的病理过程,是评估乳腺浸润性导管癌患者预后的重要指标。     

短发夹RNA沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响

目的构建以促肝细胞再生磷酸酶-3（PRL-3）为靶基因的短发夹状小干扰RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体,并探讨PRL-3-shRNA表达载体对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 构建PRL-3基因特异性shRNA表达载体,使用脂质体法将PRL-3-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞。采用Real-ti me PCR和Western blot分别检测转染后MCF-7细胞中PRL-3基因mRNA和蛋白的表达;运用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平,用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况;采用Transwell小室法检测细胞侵袭力变化。计量资料采用单因素方差分析或重复测量方差分析。结果 酶切鉴定和测序分析证实PRL-3-shRNA表达载体成功构建。转染成功后,shRNA-1~3组PRL-3基因mRNA表达分别为（0.31±0.27）、（0.15±0.14）和（0.31±0.03）,与空白组和阴性组（1.00±0.00、0.98±0.18）相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。PRL-3-shRNA-2组PRL-3蛋白的表达量明显低于阴性组和空白组（0.50±0.02比0.91±0.03和0.89±0.02,P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2转染入MCF-7细胞后能明显降低其增殖水平（P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2组凋亡率明显高于空白组和阴性组[（8.37±1.85）%比（1.60±1.58）%和（0.16±0.05）%,P〈0.05];Transwell小室侵袭实验显示,PRL-3-shRNA-2组穿膜细胞数明显低于阴性组和空白组（P〈0.05）。结论 沉默PRL-3基因表达可抑制MCF-7细胞的增殖,促进凋亡,抑制其侵袭能力     

乳腺浸润性导管癌患者血清HIF-1α、Ala-A水平变化及意义

目的探讨乳腺浸润性导管癌患者血清缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和丙氨酸（Ala-A）的水平变化及意义。方法用ELISA法检测127例乳腺浸润性导管癌患者（原发性117例、复发性10例）、20例乳腺良性肿瘤患者和31例正常人血清HIF-1α,用高效液相色谱法检测其血清Ala—A。结果乳腺浸润性导管癌患者血清HIF-1α水平明显高于良性肿瘤患者和正常人（P均〈0．01）,复发浸润性导管癌患者高于原发性者（P〈0．05）;乳腺浸润性导管癌患者血清ALa-A水平低于乳腺良性肿瘤患者和正常人（P均〈0．01）;血清HIF-1α和ALa-A水平与乳腺浸润性导管癌病理分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移有关（P均〈0.05）,HIF-1α与ALa-A呈负相关（r=0．860,P〈0．01）。结论乳腺浸润性导管癌患者血清HIF-1α和ALa-A水平有异常变化,可作为诊断乳腺浸润性导管癌的指标,并可用于评价其生物学行为。     

靶向S100A4的shRNA对乳腺癌MCF-7细胞体外侵袭力及迁移力的影响

目的探讨靶向S100A4短发夹RNA（shRNA）对MCF-7细胞侵袭力和迁移力影响的作用机制。方法构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,使用QRT-PCR和Westernblot检测转染后MCF-7细胞中s100A4的表达水平,经过脂质体介导将S100A4-shRNA表达载体转染人MCF-7细胞,G418筛选及克隆化培养。采用Trans-well小室法和划痕试验检测MCF-7细胞侵袭力和迁移力变化。结果经测序鉴定证实S100A4-shRNA表达载体成功构建。转染48h后,所构建的S100A4-shRNA-1表达载体能有效抑制MCF-7细胞中S100A4表达;MCF-7细胞形态无显著变化,但侵袭力和迁移力明显下降。结论S100A4在乳腺癌细胞侵袭和转移过程中扮演重要角色,通过沉默其表达可抑制MCF-7的侵袭力和迁移力从而抑制其转移。     

RNA干扰HER2基因对人大肠癌HT29细胞株增殖影响的研究

目的研究载体介导的靶向HER2基因的RNA干扰 (RNA interference,RNAi)对体外生长的人大肠癌HT29细胞增殖的影响。方法 将针对HER2基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体转染体外生长的HT29细胞,分别用半定量RT-PCR和Western blot检测HER2 mRNA和蛋白的表达,MTT测定各组细胞的增殖差异。结果 靶向HER2的shRNA可以有效地抑制体外生长的人大肠癌HT29细胞中HER2基因mRNA和蛋白表达,与对照组比较,实验组细胞增殖明显受到抑制。结论 靶向HER2的shRNA表达载体可以通过降低HER2基因的表达,进而抑制体外生长的大肠癌HT29细胞的增殖。     

PTEN和血管内皮生长因子在乳腺癌中的表达及其意义

目的:探讨抑癌基因PTEN蛋白在人乳腺癌中的表达情况,及其与血管内皮生长因子(VEGF)表达的相关性。方法:应用免疫组织化学染色S-P法,检测44例乳腺癌组织石蜡切片中PTEN蛋白、VEGF蛋白的表达情况,比较PTEN蛋白表达与临床病理指标的关系,及其与VEGF蛋白表达的相关性。结果:PTEN蛋白表达定位于细胞质。PTEN蛋白表达减低者占47.7%(21/44),阳性表达者占52.3%(23/44)。PTEN蛋白表达与乳腺癌是否淋巴结转移、乳腺癌雌激素状态及局部是否复发相关(P<0.05)。PTEN与VEGF蛋白表达呈负相关,但无统计学意义(r=-0.236,P=0.122)。结论:乳腺癌患者PTEN蛋白低表达与预后不良有关,PTEN对乳腺癌有一定的预后价值。在人乳腺癌中,VEGF可能是PTEN的主要下游基因。     

短发夹RNA沉默S100A4对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的观察靶向S100A4的shRNA对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法构建S100A4基因特异性shRNA表达载体,检测转染后MCF-7细胞中S100A4的表达水平以及增殖水平和凋亡率的变化。经过脂质体介导将S100A4shRNA表达载体转染人MCF-7细胞,G418筛选及克隆化培养,裸鼠体内成瘤试验检测各组细胞增殖情况。结果经测序鉴定证实成功构建S100A4-shRNA表达载体。所构建的S100A4-shRNA表达载体能够有效抑制MCF-7细胞中S100A4的表达,并且可以显著降低MCF-7细胞增殖水平以及诱导细胞进入晚期凋亡;稳定转染S100A4-shRNA表达载体的MCF-7细胞形态无显著变化,而实验组裸鼠肿瘤体积和重量明显小于空白对照组和阴性对照组。结论S100A4-shRNA表达载体能有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞中S100A4的表达,从而降低细胞增殖水平。