针灸联合丹参酮胶囊治疗中重度寻常痤疮疗效观察

目的观察针灸联合丹参酮胶囊治疗中重度寻常痤疮的疗效及对外周血白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响。方法将100例中重度寻常痤疮患者随机分为观察组与对照组,每组50例。对照组患者采用口服米诺环素胶囊治疗,观察组患者采用针灸联合口服丹参酮胶囊治疗。统计比较2组临床治疗效果及不良反应发生情况,检测2组治疗前后外周血IL-8和TNF-α水平。结果观察组治疗总有效率显著高于对照组(P 0. 05),各种不良反应发生率明显低于对照组(P 0. 05)。2组治疗后血清IL-8和TNF-α水平均明显降低(P均0. 05),且观察组降低更加显著(P均0. 05)。结论针灸联合丹参酮胶囊治疗中重度寻常痤疮患者疗效确切且安全,可能与显著降低患者外周血IL-8和TNF-α水平有关。     

Internet在寄生虫学上的应用

本文综述了国内外Internet信息网络在寄生虫学上的应用现状。全文包括四个部分,即概述、数据库、信息交流和专题讨论、重要的寄生虫学WWW站址。     

联合PCR技术克隆白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因及其生物信息学分析

目的测定白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶的基因的全长序列并用生物信息学方法分析其结构和功能。方法从白纹伊蚊卵、幼虫、蛹、雌蚊、雄蚊中提取总RNA,逆转录后以总cDNA为模板,设计简并引物进行巢式PCR,扩增部分序列后设计新的特异性引物补全5’端序列,使用3’-RACE法补全3’端序列,拼接全长后进一步进行生物信息学分析。结果通过巢式PCR扩增出1145bp的核苷酸序列,测序后设计5’端序列的下游引物,扩增出约900bp的核苷酸序列,设计3’端的上游引物,配合3’RACE试剂盒扩增出约600bp的核苷酸序列,寻找重复序列将三段序列进行拼接,得到国内外从未获得的长2244bp、编码747个氨基酸序列的白纹伊蚊漆酶型酚氧化酶基因的全长序列。生物信息学分析其与白纹伊蚊的相似性最高,为含信号肽的跨膜蛋白,含3个Cu氧化酶超家族位点,属于蓝色多铜氧化酶家族。结论联合PCR技术的应用使较长长度的基因序列的扩增更为方便、准确。为进一步对其进行功能的研究奠定了基础。     

粉尘螨第五组主要变应原（Der f5）的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第五组变应原（Dermatophagoides farinae,Derf5）基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法提取活粉尘螨总RNA,扩增Derf5片段,PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a（＋）连接,转化入大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blotting）鉴定其表达效果,Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性。结果构建了重组质粒pMD18-Derf5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符,纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性。结论获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白,初步鉴定了该蛋白的免疫原性。     

刚地弓形虫LDH-Like MDH cDNA的克隆和序列分析

目的获取弓形虫RH株速殖子苹果酸脱氢酶(MDH)的cDNA全长序列，并对推导翻译出的氨基酸(aa)序列进行分析。方法将NCBI GenBank中登录的弓形虫MDH EST序列进行比对、拼接和电子延伸，发现近5’末端的部分核酸序列缺失。基于分析，设计的上游、下游引物分别包含起始密码子ATG和终止密码子TGA(TGA→UGA)，使经RT-PCR扩增出的片段对应完整的CDS或者ORF。之后对MDHCDS推导翻译出的aa序列进行了保守功能域和同源性分析。结果本研究克隆的MDH的cDNA全长951bp，推导翻译出的蛋白质有316个aa组成，约35kDa，与预期大小接近。保守功能域分析表明，弓形虫MDH最接近类-乳酸脱氢酶型(lactate dehydrogenase-like)MDH，其准确定名缩写为LDH-like MDH，同时弓形虫MDH还具有其它脱氢酶类的特征。弓形虫MDH除与隐孢子虫和恶性疟原虫高度同源外，还与很多细菌等物种同源，但与人的同源性最低(22％)。弓形虫MDH cDNA序列在NGBI GenBank中登录号为AY650028，对应aa序列的登录号为AAT67462。结论本研究首次获得了弓形虫MDH基因的全长cDNA序列和对应的aa序列。MDH是三羧酸循环中的重要酶类，该酶活性的改变。将直接影响弓形虫的存活。弓形虫MDHaa序列与人MDH蛋白间的同源性很低，提示基于MDH蛋白作为药靶，经高通量技术筛选抗弓形虫药具有可行性。     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原（EsAg）作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

寄生虫学Internet信息网络站点的初步建立

应用HTML和Java语言，缩写网络主页及相应的网关接口程序，初步建立起寄生虫学Internet信息网络站点(http：／／WWW．gxsums.edu.ch/xxgk/zyjs/jscx/)。利用该站点可以进行寄生虫学相关资料的检索、专题讨论、查寻与寄生虫学领域有关的重要网络地址、了解中山医科大学寄生虫学教研室的发展动态以及检索本室发现的蠕虫新种和新记录以及新建立的科，亚科和属。     

血清和尿液中22种真菌毒素的高效液相色谱——四极杆轨道阱质谱筛查方法建立

目的 建立血液、尿液中22种常见真菌毒素的液液萃取-高效液相色谱四极杆轨道阱质谱测定方法。方法 基于高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱技术,首先建立22种常见真菌毒素的色谱质谱数据库。然后取血清和尿液样品,用0.10 mol/L NaOH 溶液调节至碱性,加入乙酸乙酯涡旋混合萃取,萃取液用弱的氮气吹至近干,残渣加甲醇水溶液（50∶50,v/v）复溶,经过滤后进 LC - MS/MS 分析。在一定识别标准下与数据库比对进行定性筛查。结果 尿液和血液检出限（limit of detection,LOD）分别为2.61×10 - 3～50.0 ng/ml和2.07×10 - 3～50.0 ng/ml,定量限（limit of quantitation,LOQ）分别为8.70×10 - 3～1.67×102 ng/ml和 6.91×10 - 3～1.67×102 ng/ml。尿液测定日内相对标准偏差（relative standard derivations, RSDs）为2.34%～8.40%,日间RSDs为4.80%～10.9%;血液测定日内RSDs为2.10%～10.6%,日间RSDs为3.07%～11.6%。结论 建立的快速筛查方法操作简单,具有高通量、高灵敏度和高准确性的特点,符合生物样品中毒物分析鉴定的要求,同时可以更好地发现新型毒物和未知毒物。     

气相色谱-串联质谱法测定血清中的16种多环芳烃

目的 建立血清中16种多环芳烃的气相色谱-串联质谱测定方法。方法 血清样经甲醇沉淀蛋白,加入正己烷与二氯甲烷混合溶剂萃取,萃取物氮吹至近干后,正己烷和二氯甲烷混合溶剂复溶,取1 μl上清液进样分析。16种待测多环芳烃经DB-5色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)分离,多反应监测模式监测,内标法定量。结果 本法在1.0 μg/L～2.0×10² μg/L范围内线性良好,方法检出限为4.20×10^-2 μg/L～0.27 μg/L,加标回收率为79.7%～108.0%,精密度为2.57%～6.76%。结论 本方法具有灵敏、快速、回收率和重复性好等优点,满足人血清中多种多环芳烃测定的要求。     

粉尘螨主要变应原Derf1基因的改造与可溶性表达

目的在大肠杆菌中提高粉尘螨1类变应原（Derf1）的可溶性表达。方法用RT-PCR方法扩增得到Derf1的全长序列与成熟肽序列（mDerf1）；以已知DerP5基因的前导序列替换Derf1前导序列和原酶序列，重新构建出rDerf1基因；将上述3个基因分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中表达，经Western-blot对三者的表达产物进行分析鉴定。结果Western-blot表明，pGEX-Derf1与pGEX-mDerf1的表达产物分别为分子量约63000与51000的重组蛋白质，重组蛋白质主要存在于细胞裂解液的沉淀中。pGEX-rDerf1大量表达了可溶性目的蛋白质，分子量约53000，并被成功地分离纯化。以上三种表达产物均可被鼠抗GST抗体与螨过敏患者血清特异地识别。结论表达了含Derf1，mDerf1与rDerf1的三种GST融合蛋白质，它们均具免疫反应性，纯化获得了GST-rDerf1融合蛋白质，为后期的诊断及治疗奠定了基础。