农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系的优化

目的 该研究在已有高卢蜜环菌遗传转化体系的基础上，对遗传转化体系进行优化以提高转化效率，为后续蜜环菌分子标记辅助育种、基因功能的研究奠定基础。方法 首先构建遗传转化的质粒pH101-PAgGPD-GFP-TrpC，将其转化到大肠埃希菌中扩大培养并提取质粒。提取的质粒分别转化LBA4404，EHA105，GV3101，AGL-1共4种不同的农杆菌。用转化后的农杆菌浸染高卢蜜环菌，筛选出转化率最高的农杆菌。再分别从抗生素种类及浓度、共培养时间、菌液浓度和浸染方法5个方面对农杆菌介导的高卢蜜环菌遗传转化体系进行优化。采用Synbiosis ProtoCol 3测量影像分析仪观察蜜环菌在不同条件下的表型谱。结果 优化后高卢蜜环菌遗传转化条件为农杆菌菌株采用EHA105，菌液浓度为吸光度A_{600 nm}=0.6；共培养时间为2 d，浸染方式为负压浸染10 min，初筛培养基为含400 mg·L^-1头孢噻肟钠，10 mg·L^-1潮霉素的PDA培养基，复筛培养基为含12 mg·L^-1潮霉素的PDA培养基。结论 该研究在已经建立的高卢蜜环菌的遗传转化体系的基础上成功对该体系进行了优化，且优化前后的转化率差异存在明显统计学意义（P<0.05），即优化后高卢蜜环菌的转化效率约为4.33%，相比于优化前提高了约8倍。     

一种大豆秸秆蜜环菌培养基及其生产条件的优化

目的 为了解决天麻栽培中对木材的大量使用造成的森林资源破坏及栽培成本增加问题,该研究对农作物余料替代木材（或木屑）培养蜜环菌的可行性进行了探讨,以期降低天麻的栽培成本,同时使农作物余料得到有效利用,进而保护林木资源。方法 观察蜜环菌的生长情况,划线法测量蜜环菌生长速度;苯酚浓硫酸法测定不同培养基中蜜环菌的总多糖含量;为了进一步优化大豆秸秆培养基配比,对主料配比、蔗糖含量、无机盐含量及含水量进行四因素三水平L₉（3⁴）正交优化试验。结果 通过比较不同培养基培养中蜜环菌的生长情况,发现大豆秸秆培养基培养的蜜环菌从接种第4天就开始生长,菌丝长势好,生长速度为0.352 cm·d^-1,是桦木屑培养基生长速度0.283 cm·d^-1的1.48倍;大豆秸秆培养基培养的蜜环菌总多糖含量最高,为39.260 mg·g^-1,远远高于桦木屑培养的蜜环菌总多糖含量17.028 mg·g^-1,大豆秸秆培养基优势明显;主料（大豆秸秆与麦麸）配比为8∶2,蔗糖含量为主料的1%,无机盐含量为主料含量的0.5%,含水量50%时,蜜环菌生长速度稳定为0.392 cm·d^-1。结论 该研究结果为天麻栽培中使用大豆秸秆培养基替代木材（或木屑）培养基培养的蜜环菌提供了依据,为天麻在栽培中减少林木资源浪费、保护自然环境提供了参考。     

外源性物质对猪苓菌丝体生长及多糖含量的影响

目的 为探讨不同外源性物质对猪苓菌丝生长发育的影响,系统研究了不同浓度外源性物质处理后猪苓菌丝生长速度及其多糖含量,以期筛选出猪苓菌丝的最佳生长条件,为其规模化人工培养提供参考。方法 采用平皿培养真菌的方法,将猪苓菌丝放在含有不同外源性物质的培养基上进行了培养,以菌落直径来判断菌丝的生长速度,苯酚-硫酸法测定猪苓菌丝的多糖含量。结果 高浓度环磷腺苷酸,6-苄氨基嘌呤（6-BA）,赤霉素（GA）,2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）,维生素（V）B₁,VB₃,VB₆,VB₉,VB₁₂处理组均促进了猪苓菌丝生长,而吲哚乙酸（IAA）,VC,VB₂处理组均抑制了猪苓菌丝生长;高浓度环磷腺苷酸,6-BA,GA,2,4-D,VB₁,VB₃,VB₆,VB₉,VB₁₂处理组均提高了猪苓菌丝多糖含量,而IAA,VB₂处理组均降低了其多糖含量。高浓度VC处理组对猪苓菌丝生长抑制最为明显,但能显著增加猪苓菌丝多糖含量;环磷腺苷酸浓度为2 mmol·L^-1,6-BA,GA,2,4-D,VB₁,VB₂,VB₃,VB₉,VB₁₂质量浓度分别为6,15,2,4,2,4,6,10 mg·L^-1时,均有利于猪苓菌丝生长和多糖含量的累积。结论 通过在培养基中添加外源物质可以调控猪苓菌丝的生长发育,改变猪苓菌丝生长速度和多糖含量的累积。     

金银花种质资源DNA身份证构建及遗传相似性分析

利用22对SSR引物对20个产地58个金银花农家种进行扩增,从中筛选出7对多态性较强、扩增带型稳定的引物建立金银花种质资源DNA身份证。结果表明,7对核心引物可将58个金银花农家种区分。采用Pop Gene32(vesion1.32)软件包对58个金银花农家种进行遗传相似性分析,相似系数变异范围为0.366 7~0.916 7。依据相似系数,可反映58个金银花农家种之间的亲缘关系,并将58个农家种遗传一致性分为4类,为金银花的优良种质选育提供参考信息,为中药材道地性研究提供理论依据。     

金银花配方颗粒质量快速检测体系研究

中药配方颗粒在临床上的应用逐渐广泛,但目前缺乏快速简便的质量控制方法。该研究将位点特异性PCR技术和酶联免疫检测方法(ELISA)用于金银花配方颗粒质量的快速检测,即利用位点特异性PCR技术对金银花配方颗粒进行真伪鉴别,利用酶联免疫检测技术对金银花配方颗粒进行指标性成分的快速检测,从而为金银花配方颗粒质量快速检测标准建立奠定基础,也为其他中药配方颗粒质量标准的研究提供参考。     

快速筛选高纯合度天麻PCR-RFLP鉴定方法

目的 建立一种快速筛选高纯合度天麻种质材料的方法，为其纯系育种和杂交育种奠定基础。方法 以本课题组前期天麻全基因组测序和群体重测序为基础，利用单核苷酸多态性（SNP）位点开发20个限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）标记，并采用聚合酶链式反应（PCR）-RFLP法对15份天麻种质的20个RFLP标记进行限制性内切酶实验，根据20个RFLP标记位点酶切条带数目，计算15份天麻种质的纯合度，进而对天麻种质纯合度进行评估；在此基础上，利用基因组重测序技术对评估结果进行验证。结果 利用PCR-RFLP法筛选获得10份纯合度>95%的种质材料，其中3份种质材料的纯合度为95%，7份种质材料的纯合度为100%；利用基因组重测序法筛选获得9份纯合度>95%的种质材料，其中8份种质材料与PCR-RFLP法检测结果一致。结论 该文所建立的用于筛选高纯合度天麻种质的PCR-RFLP法精确度为80%，准确率为89%。该方法实验操作简便、检测效率高，且成本显著低于基因组重测序技术，为天麻纯系育种提供了技术支撑，也为其他中药材品种选育研究提供了借鉴。     

盐胁迫蜜环菌Real-time PCR内参microRNA的筛选

目的:在利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)进行microRNA(miRNA)表达分析的过程中,选择合适的内参miRNA对数据标准化起到重要作用。方法:该文挑选了13个蜜环菌候选miRNA对其前体进行生物信息分析,PMRD预测其前体相似序列,并用RNAfold对候选miRNA前体及其相似序列进行二级结构预测。利用Real-time PCR检测在受盐胁迫前后两种基因型蜜环菌(基因型A,基因型B)miRNA的表达量,并结合geNorm,NormFinder,BestKeeper软件分析其表达稳定性,筛选合适的内参。结果:对候选miRNA的9条前体进行二级结构预测以及特征分析,证明预测的miRNA属于miR家族具有典型的茎-环结构且成熟的miRNA位于其前体的5'或是3'端;geNorm分析表明,基因型A蜜环菌可选择Novel-4*,Novel-9作为内参组合,基因型B可选择Novel-9,Novel-16作为内参组合;NormFinder分析结果显示,Novel-9在基因型A蜜环菌和基因型B蜜环菌中都有较好的稳定性;BestKeeper分析显示Novel-12*在基因型A蜜环菌中稳定性较好,Novel-2*在基因型B蜜环菌中稳定性较好。结论:稳定性最优的内参miRNA为Novel-9,为进一步开展蜜环菌miRNA调控机制研究奠定了基础。     

内生细菌资源及其次级代谢产物研究进展

内生细菌是宿主内生态系统的重要组成部分,存在于宿主内部且不会对宿主造成明显伤害,其种类多样、分布广泛,是一类重要的微生物资源,具有成为潜在中药资源的可能。内生细菌在与宿主长期协同进化的过程中,逐渐形成了对抗、互惠等多种关系,能够直接或间接调节宿主的生长发育、协助宿主抵抗病虫害及环境胁迫等生物过程。内生细菌在与宿主互作的过程中能够产生丰富多样的次级代谢产物,逐渐成为新型天然产物开发研究的资源库,发挥了重要的作用。近年来,内生细菌及其次级代谢产物广泛应用于新药研发、生物防治等领域,展现出巨大的研究与开发价值。该文综述了内生细菌资源的多样性、种属鉴定方法、次级代谢产物及其在农业、医药领域应用等方面的研究进展,并对未来发展方向进行了探讨,为中药内生细菌资源的研究、开发利用提供参考,拓展和提升中药资源价值。     

BBM基因对西洋参愈伤组织生长及人参皂苷含量的影响

Baby Boom(BBM)基因是植物细胞全能性的关键调节因子,在胚胎发育再生、细胞增殖、愈伤组织快速生长、促进分化等方面起着重要的作用。由于西洋参遗传转化体系存在转化不稳定、转化效率低、转化周期长等问题,该研究拟利用基因枪法将玉米BBM基因转入到西洋参愈伤组织中,以研究其对愈伤组织的生长以及人参皂苷含量的影响,为建立高效的西洋参遗传转化体系奠定基础。经草铵膦抗性筛选及PCR分子鉴定共获得4个不同转化事件的西洋参转基因愈伤组织,对野生型和转基因愈伤组织在相同时间内的生长状态、生长速率进行比较;利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)对转基因愈伤组织中人参皂苷成分含量进行测定。结果表明,转BBM基因西洋参愈伤组织的生长速率显著高于野生型,人参皂苷Rb₁、Rg₁、Ro及Re的含量均显著高于野生型。该研究初步明确了BBM基因具有提高西洋参愈伤组织的生长速率及人参皂苷含量的作用,为进一步建立稳定、快速、高效的人参属物药用植物遗传转化体系提供依据。     

环境胁迫影响药用真菌生长及生理生化机制的研究进展

为探究环境胁迫条件对药用真菌生长及生理生化机制的影响,本文就近年来食用及药用真菌在环境胁迫条件的生长代谢变化规律进行系统总结,旨在为药用真菌质量形成机制研究、药用真菌分子育种研究以及提高药用真菌产量和质量提供依据。同时,环境胁迫也可诱导药用真菌产生独特的生物代谢途径,为其提供了产生具有活性的新化合物的潜力,也可为利用药用真菌进行药物开发奠定基础。