龟甲的特异性PCR及高分辨率熔解曲线技术鉴别方法研究

目的:建立高效、稳定的龟甲Testudinis Carapax et Plastrum DNA鉴别方法。方法:利用龟甲的特异性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)鉴别方法和高分辨率熔解曲线(HRM)鉴别方法,根据龟甲及其混伪品COI序列差异,寻找特异性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点设计鉴别引物,并对PCR反应条件进行优化;并使用通用引物扩增COI区域,产物直接进行HRM分析。结果:当退火温度为60℃,循环次数为35,使用设计的龟甲特异性鉴别引物GJ-360.F/R进行PCR扩增,经扩增均获得约360 bp特异性鉴别条带,混伪品皆无条带;使用通用引物RonM-tl和Vl-tl进行PCR扩增,产物使用HRM分析,龟甲药材在模板DNA质量浓度为3.5～87.9 ng·μL~(-1)、引物浓度为0.2μmol·L~(-1)、镁离子浓度为2.0 mmol·L~(-1)的条件下,龟甲药材标准熔解曲线为双峰,其T_m均值分别为(83.15±0.76)、(87.53±0.69)℃。结论:特异性PCR和HRM均可作为一种快速准确鉴别龟甲正伪品的鉴定方法。     

盐胁迫蜜环菌Real-time PCR内参microRNA的筛选

目的:在利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)进行microRNA(miRNA)表达分析的过程中,选择合适的内参miRNA对数据标准化起到重要作用。方法:该文挑选了13个蜜环菌候选miRNA对其前体进行生物信息分析,PMRD预测其前体相似序列,并用RNAfold对候选miRNA前体及其相似序列进行二级结构预测。利用Real-time PCR检测在受盐胁迫前后两种基因型蜜环菌(基因型A,基因型B)miRNA的表达量,并结合geNorm,NormFinder,BestKeeper软件分析其表达稳定性,筛选合适的内参。结果:对候选miRNA的9条前体进行二级结构预测以及特征分析,证明预测的miRNA属于miR家族具有典型的茎-环结构且成熟的miRNA位于其前体的5'或是3'端;geNorm分析表明,基因型A蜜环菌可选择Novel-4*,Novel-9作为内参组合,基因型B可选择Novel-9,Novel-16作为内参组合;NormFinder分析结果显示,Novel-9在基因型A蜜环菌和基因型B蜜环菌中都有较好的稳定性;BestKeeper分析显示Novel-12*在基因型A蜜环菌中稳定性较好,Novel-2*在基因型B蜜环菌中稳定性较好。结论:稳定性最优的内参miRNA为Novel-9,为进一步开展蜜环菌miRNA调控机制研究奠定了基础。     

SmartRoot在蜜环菌菌索表型谱分析中的应用

目的:建立获取精确的表型谱数据研究平台,是目前中药资源研究亟待解决的技术难点。如传统的蜜环菌菌索表型表征方式多为描述性文字,存在较大的主观性和经验性,亟需一种客观并准确的方法进行蜜环菌菌索表型的表征。方法:基于图像处理软件Image J和根系识别插件SmartRoot与Synbiosis ProtoCol 3影像分析仪相结合,对蜜环菌平板生长图片进行分析,测定蜜环菌菌索长度、生长速度、分枝情况、新生菌索夹角等,建立蜜环菌菌索表型谱分析测量体系。结果:基于该文开发的方法,可以在不影响蜜环菌生长情况下,实时分析蜜环菌菌索的生长长度、生长速度、分枝数、新生菌索夹角等表型谱变化,继代后9～12 d的蜜环菌生长最为迅速,新生菌索与母体菌索之间夹角接近垂直。该方法与传统的蜜环菌生物量表型参数干重呈现一定的相关性,具有较好的实际应用价值。结论:该研究建立了一套客观、准确、快捷和实时的蜜环菌菌索表型谱分析测量体系,拓展了SmartRoot的应用范围,可用于受控实验条件下中药资源的表型谱分析。