感觉神经元特异性受体rMrgE基因的克隆与表达

目的 克隆感觉神经元特异性受体rMrgE基因并于HEK293细胞中表达.方法 利用聚合酶链式反应技术,从大鼠背根神经节总RNA中扩增出目的基因rMrgE,克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisB中,构建真核表达rMrgE载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株.采用RT-PCR、免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定.结果 与结论含有rMrgE基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上.本研究为进一步探究rMrgE受体的功能奠定了基础.     

吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库的构建

目的:构建吗啡依赖模型大鼠脑cDNA文库.方法:建立大鼠吗啡躯体依赖模型后,取鼠脑进行总RNA的抽提、mRNA的纯化,以mRNA为模板合成第一链cDNA后用LD-PCR方法合成双链cDNA,用限制性内切酶SfiⅠA、B分别双酶切双链cDNA与pTRG载体,连接后的cDNA文库转化XL1-Blue MRF′ Kan 超级感受态并收菌,完成cDNA文库构建.结果与结论:PCR结果显示,cDNA片段连接效率＞90%,cDNA插入片段在1 kb左右.吗啡依赖大鼠脑cDNA文库总容量为3.05×106,满足下一步细菌双杂交文库筛选要求.     

大麻素CB1受体对条件性药物渴求的控制作用

最近研究表明,大麻素CB1受体是用于治疗药物成瘾的一个新靶标。CB1受体存在于大脑激动环路,能调节药物摄取。在模拟人类成瘾的诱导复发动物模型上,阻断CB1受体能减弱暗示诱导性药物渴求的恢复。在多种滥用药物如精神兴奋剂、阿片、尼古丁及酒精等均可观察到防复发的作用。此外,CB1受体在奖赏相关性记忆中也有重要作用,这与内源性大麻素在记忆相关的可塑性中的作用相一致。临床试验证明,CB1受体拮抗剂利莫那班能够抑制复发反应和体重增加。总之,临床及临床前研究均表明,CB1受体拮抗剂为成瘾行为开辟了一种新的治疗途径。     

噻吩诺啡强镇痛和低依赖药理学特性与其激动中枢阿片受体的关系

目的从整体动物水平探讨噻吩诺啡强镇痛和低依赖的药理学特性与激动中枢阿片受体的关系。方法在小鼠乙酸扭体和热辐射甩尾模型上,利用阿片μ和κ受体特异性拮抗剂评价噻吩诺啡对阿片μ和κ受体选择性作用的强度;在小鼠躯体依赖模型上,利用κ受体特异性拮抗剂评价噻吩诺啡低依赖性是否与其激动中枢κ受体的作用有关。结果在小鼠乙酸扭体模型和热辐射甩尾模型上,脑室注射κ受体特异性拮抗剂nor-binaltorphimine(Nor-BNI)可以显著抑制噻吩诺啡的镇痛效果,使其镇痛作用分别下降28%(乙酸扭体模型)和29%(热辐射甩尾模型);μ受体特异性拮抗剂纳络肼也能显著抑制噻吩诺啡的镇痛效果,使其镇痛作用分别下降40%(乙酸扭体模型)和44%(热辐射甩尾模型),略强于κ受体拮抗剂Nor-BNI。在小鼠躯体依赖模型上,Nor-BNI伴随噻吩诺啡连续给药后纳洛酮催促,小鼠未出现跳跃等躯体依赖的戒断症状。结论噻吩诺啡在小鼠疼痛模型上的镇痛作用与其激动中枢μ和κ受体均有关。噻吩诺啡躯体依赖潜能低与其激动中枢κ受体无必然联系。     

ABIN1对μ阿片受体活性的抑制作用

目的 A20结合的核因子抑制蛋白(ABIN1蛋白)是通过细菌双杂交技术筛选得到的与MOR羧基端(C-端)有相互作用的蛋白。本研究在确定ABIN1蛋白与μ阿片受体(MOR)相互作用的基础上,明确ABIN1对MOR受体激动活性及MOR激活后信号通路的影响。方法 (1)用GST-pull-down实验、免疫荧光细胞化学共定位及免疫共沉淀(Co-IP)实验验证ABIN1与MOR-C有无相互作用。(2)建立稳定转染ABIN1与MOR的CHO细胞株,用[3H]diprenorphine进行受体配体结合实验,观察ABIN1对MOR与配体结合力的影响。(3)用[35S]GTP-γS实验,观察ABIN1对MOR激动活性的影响。(4)通过SDS-PAGE电泳观察ABIN1对MOR激活后受体磷酸化及ERK/p-ERK水平的影响,通过cAMP含量测定确定ABIN1对DAMGO急性作用于MOR抑制cAMP作用的影响。结果 GST-pulldown实验在细胞外证明ABIN1与MOR-C有相互作用,免疫荧光细胞化学共定位实验表明ABIN1与MOR在胞膜存在共定位,Co-IP实验证明在细胞水平ABIN1与MOR有相互作用。[3H]diprenorphine受体配体结合实验表明ABIN1对MOR受体配体亲和力没有明显影响,[35S]GTP-γS实验证明ABIN1能够抑制激动剂对MOR的激动活性,EC50值显著增加(P<0.05)。量效曲线右移。ABIN1能够明显抑制DAMGO作用于MOR后对cAMP含量的降低作用(P<0.05),ABIN1明显抑制MOR的磷酸化(P<0.05),ABIN1对MOR激活后的p-ERK水平有明显的抑制作用(P<0.01),对ERK水平没有明显影响。结论 ABIN1与MOR相互作用后抑制MOR受体激动活性、MOR的磷酸化及受体后信号通路。     

与A20结合的核因子-κB抑制蛋白1的研究进展

与A20结合的核因子κB抑制蛋白1（A20 binding inhibitor of NF-κB activation,ABIN1）是近年来研究发现的一个新泛素结合蛋白。最初的研究表明,ABIN1通过结合锌指结构蛋白A20在NF-κB信号通路中发挥重要的调节作用。目前发现,ABIN1在过表达的条件下能抑制肿瘤坏死因子、白细胞介素1、脂多糖、表皮生长因子等诱导的NF-κB的活性,从而发挥抗炎和免疫调节作用。因此,以ABIN1为新靶点调节NF-κB活性的研究日益受到关注。本文就ABIN1蛋白结构、功能及其研究进展做一综述。     

文献调研在医学科研中的作用

以医学科研中遇到的实际问题为例,详细分析了文献调研在选题、实验设计、实施实验、分析结果和撰写总结报告5个阶段中的不同作用。     

l-四氢巴马汀对羟考酮依赖大鼠神经元损伤的保护作用

 目的探讨羟考酮依赖引起大鼠海马CA1区和中脑腹侧被盖区(VTA)内神经元的损伤情况,以及l-四氢巴马汀(l-THP)对羟考酮依赖大鼠神经元损伤的保护作用。方法采用连续递增给羟考酮建立依赖模型:大鼠连续给药22 d,每天2次,从第1天到第8天,从开始剂量2 mg·kg^–1,每日递增1 mg至第8天固定为9 mg·kg^–1,直到第22天。l-THP伴随给药,l-THP灌胃给药40 min后给羟考酮。末次给药24 h后,取脑,石蜡切片,采用ABC法测海马CA1区和VTA内GFAP的免疫组织化学反应,以其阳性神经元的平均吸光度值表示其含量。结果羟考酮引起大鼠海马CA1区和VTA内GFAP含量明显升高,提示羟考酮能造成神经元损伤。l-THP(15,30 mg·kg^–1)抑制海马CA1区和VTA内GFAP含量的升高。结论长期大剂量给予羟考酮能造成大鼠神经元损伤,l-THP对羟考酮依赖大鼠神经元损伤有保护作用。     

阿片受体C-末端的功能及与其相互作用蛋白的研究进展

阿片受体C-末端氨基酸在激动剂作用后受体的磷酸化、脱敏及内吞过程中发挥了重要作用,C-末端部分缺失或不同氨基酸位点的突变对受体功能有明显影响,如μ阿片受体C-末端的Thr394、Thr383、Thr357、Ser355,δ受体C末端的Ser363和κ受体C末端的Ser369等。除了公认的参与阿片受体C-末端磷酸化的激酶,近年来,人们寻找到其他一些与C-末端相互作用的蛋白,这些相互作用蛋白对阿片受体功能有不同的影响,如PPL、FilaminA、PLD2、PKCI、GASP和EBP50/NHERF等,但不能很好的解释阿片类物质的依赖、耐受与成瘾。因此,寻找特异性与C-末端相互作用的蛋白,成为阿片成瘾机制研究的一个方向。     

感觉神经元特异性受体rMrgD基因的克隆与表达

目的克隆rMrgD基因并于HEK293细胞中表达。方法利用聚合酶链反应技术,从总RNA中扩增出目的基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达rMrgD载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株。通过免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定。结果直接和间接免疫荧光实验皆表明rMrgD主要定位于细胞膜上,Western印迹检测证实rMrgD在HEK293细胞主要以单体和二聚体形式存在。结论含有rMrgD基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上。本研究为进一步探究rMrgD受体的功能奠定了基础。