miR －7对乳腺癌细胞骨转移的影响

目的：探讨miR－7抑制乳腺癌细胞骨转移的分子机制。方法转染含miR－7基因序列的GFP表达质粒进入MDA－MB－231乳腺癌细胞，荧光显微镜下检测外源基因的整合效率，Western blot方法检测PI3K、AKT－2、CXCR－4和MMP－9的蛋白表达量，Transwell体系检测乳腺癌细胞的迁移能力；建立乳腺癌骨转移模型，病理检查分析骨转移情况；miRNA靶基因预测软件分析miR－7潜在治疗靶点。结果荧光显示含GFP／miR－7基因的质粒被高效转入乳腺癌细胞，转染后癌细胞PI3K、AKT－2和CXCR－4的蛋白量均有明显降低（ P＜0.05， P＜0.01），MMP－9无明显变化（P＞0.05）；体内外模型均显示miR－7可抑制乳腺癌细胞的远位转移；miRNA靶基因预测软件分析显示PI3K是miR－7的潜在沉默靶点之一。结论 miR－7可能通过靶向沉默PI3K／AKT－2通路途径间接影响CXCR－4／SDF－1轴进而抑制乳腺癌细胞的骨转移。     

maspin和p53在乳腺癌中的表达及临床意义

目的探讨maspin和p53在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法选取河北省盐山县人民医院及天津市第五中心医院共96例乳腺癌标本及25例正常乳腺组织标本,采用免疫组织化学方法检测maspin和p53的表达情况,分析其与乳腺癌患者临床病理特征间的关系及二者的相关性。结果 96例乳腺癌标本中,maspin表达阳性率为44.79%（43/96）,明显低于其在正常乳腺组织中的表达〔72.00%（18/25）,χ2=5.8738,P=0.015 4〕;p53表达阳性率为61.46%（59/96）,明显高于其在正常乳腺组织中的表达〔8.00%（2/25）,χ2=20.5869,P=0.0000〕。maspin和p53阳性表达均与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关（P〈0.05）,而均与患者年龄、肿瘤大小、组织学类型及组织学分级无关（P〉0.05）,且maspin阳性表达与p53阳性表达呈负相关（rs=-0.447,P=0.000）。结论 maspin和p53在乳腺癌演进过程中扮演重要角色,提示二者可作为预测乳腺癌生物学行为及预后的参考指标,并为乳腺癌的治疗提供了新的研究靶点。     

脑源性神经营养因子对低温移植干细胞的环境营养与促神经分化作用

我们利用脑源性神经营养因子(BDNF)的营养神经及其易于诱导干细胞向神经元分化的双重作用机制,观察BDNF对亚低温环境下移植干细胞的环境营养作用以及其促进向神经元分化的体内实际效果.     

水通道蛋白4小RNA干扰技术优化亚低温治疗脑水肿

目的 应用针对靶向水通道蛋白4(aquapofin 4,AQP-4)的小RNA(siRNA)干扰技术优化亚低温减轻颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)后脑水肿程度的治疗效果.方法 构建沉默AQP-4 mRNA表达的siRNA质粒;液压打击法建立大鼠TBI模型,分TBI对照组、AQP-4 siRNA治疗组、亚低温治疗组、AQP-4 siRNA及亚低温联合治疗组;提取第1、3、5、7天脑组织总RNA和总蛋白,RT-PCR和Western blot方法 检测AQP-4的mRNA和蛋白表达水平;干/湿比重法和Evans蓝测定法观察大鼠TBI后不同时相脑组织含水量和血脑屏障通透性改变;实验动物予以神经功能缺陷综合评分.结果 亚低温在减轻TBI后脑水肿程度方面优于AQP-4 siRNA,但siRNA技术在沉默AQP-4表达方面强于亚低温,联合应用AQP-4 siRNA和亚低温在TBI后降低脑水肿程度方面获得最佳治疗效果.结论 靶向AQP-4的Si RNA干扰技术可优化亚低温在TBI后降低脑水肿方面的治疗效果.     

BMSCs作为HSV-tk载体联合CX43增强旁效应治疗胶质瘤的实验研究

目的 以骨髓间充质干细胞(BMSCs)为自杀基因HSV-tk载体,联合连接蛋白CX43介导的旁效应,对以BMSCs肿瘤追踪特性为基础的胶质瘤进行治疗研究.方法 以CX43质粒转染C6胶质瘤细胞,以腺病毒介导HSV-tk转染BMSCs;建立C6胶质瘤模型,实验动物分为4组:C6对照组、CX43-C6组、tk-BMSCs/C6/GCV治疗组和tk-BMSCs/CX43-C6/GCV治疗组.观察动物生存期,MRI监测肿瘤体积;脑切片行PCNA、原位凋亡检测肿瘤中央与边缘部位细胞增殖与凋亡情况.结果 CX43组、tk/GCV组生存期长于对照组,二者联合治疗组生存期最长,MRI示部分肿瘤消失;肿瘤内部与边缘细胞增殖活性下降,凋亡明显.结论 tk-BMSCs/GCV体系可有效杀伤侵袭瘤细胞在内的胶质瘤灶,连接蛋白CX43可增强此治疗效果.     

脐带间充质干细胞分离、鉴定与神经分化

目的原代分离培养脐带间充质干细胞（UCMSCs），并就其向神经细胞方向分化潜能予以研究，为脑创伤后神经组织再生修复提供理论依据。方法采用原代贴壁培养法分离培养人UCMSCs，取第4代UCMSCs进行流式细胞术检测UCMSCs表面特异标志物表达；经神经诱导后应用细胞免疫荧光技术检测神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达和神经元标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白（MAP-2）表达。结果流式细胞术结果显示UCMSCs强表达CD29、CD44、CD105，极低表达CD31、CD34、CD45，检测结果符合人UCMSCs特征。细胞免疫荧光结果显示UCMSCs经诱导后GFAP阳性表达率为56．23％，NSE阳性表达率为22．15％，MAP-2阳性表达率为27．34％。结论采用原代细胞贴壁培养法可成功分离培养人UCMSCs，在适当诱导条件下，UCMSCs可实现向神经细胞方向的成功分化，为脑创伤后神经组织修复、再生提供可能。     

RNAi下调PIK3 CB表达抑制U251胶质瘤细胞生长的体内外研究

目的 探讨应用RNAi技术靶向磷酸肌醇酯-3-激酶β催化亚单位(PIK3CB)抑制恶性胶质瘤细胞系U251的PIK3CB表达后在体内外对U251细胞生长抑制作用.方法 将短发夹RNA(shRNA)表达载体psiRNA-PIK3CB进行脂质体介导的U251人脑恶性胶质瘤细胞系表达,检测细胞转染前后的细胞增殖能力和凋亡的变化.应用裸鼠皮下荷瘤模型观察脂质体介导shRNA基因治疗对U251细胞生长抑制作用,对肿瘤组织应用免疫荧光双染色和免疫组化的方法分析结果.结果 靶向PIK3CB的shRNA转染后U251细胞生长受到抑制,细胞周期出现G2/M阻滞,细胞明显凋亡.裸鼠皮下荷瘤模型实验显示psiRNA-PIK3CB显著抑制皮下肿瘤生长(P＜0.01).结论 靶向PIK3CB的shRNA基因治疗可以成为胶质瘤治疗的新策略.     

反义miR-21抑制异种移植U251人脑胶质瘤生长的体内研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制裸鼠荷皮下U251人腩胶质瘤生长的疗效和机制. 方法 原位注射miR-21反义寡聚核苷酸(AS.miR-21)治疗裸鼠皮下荷U251人脑胶质瘤.定时测量肿瘤大小评估原位注射AS-miR-21治疗效果:使用Real time PCR和原位杂交方法鉴定治疗后miR-21表达水平下调;采用HE染色和免疫组织化学染色(PCNA、PTEN、MMPs、和Septins)评价治疗后肿瘤牛物学性状改变;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡. 结果 肿瘤生长曲线显示AS-miR-21治疗组肿瘤生长速度及体积小于空白对照与无义序列治疗组(F=52.458,P=0.000);Real-time PCR法:AS-miR-21治疗组miR-21表达下调为对照组的0.018±0.009:原位杂交显示AS-miR-21治疗组miR-21表达水平较对照与无义序列治疗组下调:组织病理学检测表明AS-miR-21治疗后肿瘤恶性度降低;TUNEL法检测可见AS-miR-21治疗组细胞凋亡数显著高于对照与无义序列治疗组(F=141.021,P=0.000).结论 以miR-21作为靶点抑制异种移植U251人脑胶质瘤生长,miR-21可能通过上调抑癌基因PTEN抑制胶质瘤的生长,可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

ts-SV40LT抗原转基因干细胞增殖活性的温度调控机制分析

Objective To study the mechanism of temperature control proliferation of the stem cells modified by ts - SV40LT gene for establishing a basement on stem cells transplantation into injured brain area during hypothermia treatment. Methods After transfecting plasmid containing temperature - sensitive simian virus 40 large T - antigen (ts - SV40LT) into umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs), PCR method was used to detect gene integration. Then we cultured these UCMSCs modified by ts - SV40LT in 33℃ and 37℃ incubators respectively. Immumofluorescence was used to detect proliferating cell nuclear antigen (PCNA)activity, telomerase activation analysis by PCR- ELISA telomerase detect kit, and cell cycle by flow cytometry.Then cell cycle regulating proteins, including Cyclin D1, CyclinE, CDK2, CDK4, CDK6, P16 and P21, were detected by westerm blot. The expression of nestin, neurone specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein(GFAP) were detected by immunofluorescence method. Results The ts - SV40LT gene was integrated into UCMSCs successfully. When cultured at 33℃ incubator, the new cell line displayed high proliferation activity, as well as its telomerase activation, highly expressed Cyclin D1, CyclinE, CDK2, CDK4 and CDK6, and lowly expressed P16 and P21, meanwhile, highly nestin, lowly NSE and GFAP. But when cultured at 37℃ incubator, the cell line showed a completely converse profile. Conclusion The proliferation of stem cells can be regulated by temperature through effective ts -SV40LT gene transfection, and that supports the clinical application of stem cells transplantation into injured brain area during hypothermia treatment.