弓形虫NT株猪体人工发病实验研究

目的 探讨猪弓形虫病人工发病条件。方法将8头30日龄断奶仔猪分为A1组：腹腔注射1000万个弓形虫速殖子;A2组：腹腔注射5000万个弓形虫速殖子;A3组：腹腔注射1亿个弓形虫速殖子;A4组：空白对照。将8头5月龄育肥猪分为B1组：腹腔注射1000万个弓形虫速殖子;B2组：腹腔注射5000万个弓形虫速殖子;B3组：腹腔注射1亿个弓形虫速殖子;B4组：空白对照。以猪源刚地弓形虫强毒虫株南京汤山株（NT株）F275代攻毒观察临床症状及剖检变化。结果A组实验猪3～7d后三种感染方式均出现典型的弓形虫病症状：持续高温、精神倦怠、呼吸困难、食欲不振等临床症状,A2、A3组感染猪弓形虫病症状明显且出现实验猪死亡,肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结肿大、出血,并从血液和淋巴结中分离到了弓形虫。B组实验猪则没出现典型的临床症状。结论30日龄断奶仔猪腹腔注射5000万个～1亿个弓形虫速殖子可出现典型的猪弓形虫病症状。     

霍乱毒素B亚单位与热休克蛋白65功能表位融合蛋白皮下免疫加剧动脉粥样硬化

目的　研究热休克蛋白65　B细胞表位经皮下免疫高脂膳食动物对动脉粥样硬化（As）斑块生成的影响。方法　利用HSP65上与炎症性自身免疫性疾病相关的两段功能表位P1（179-190）、P2（31-46）,以CTB为载体蛋白构建高效表达载体pET28a-CTB-p117,提取纯化获得可用于动物实验的蛋白,皮下免疫新西兰大白兔,比较抗HSP65抗体、血液总胆固醇含量变化与主动脉粥样硬化斑块的生成情况。结果　能够诱导产生抗HSP65的抗体,血液中总胆固醇含量与对照组比较显著提高,并且能显著增加主动脉As斑块生成（P<0.05）。结论　HSP65相关表位蛋白以CTB为载体蛋白,在弗氏不完全佐剂条件下,经皮下免疫能显著加重As斑块生成,分析是因为抗HSP65抗体生成,促进炎症反应,脂类代谢变化进而促进As斑块的形成。可基于此,利用以上表位,改变免疫方式,设计出可用于降低斑块生成的抑制As斑块生成的免疫调节剂。对于CTB单独皮下免疫也致As斑块加重的结果需进一步实验考察验证。     

热休克蛋白保守性B细胞表位黏膜免疫可增强免疫应答

目的:通过分枝杆菌热休克蛋白保守性B细胞表位多次免疫小鼠,研究热休克蛋白65(HSP65)与动脉粥样硬化之间的关系。方法:PCR技术扩增出HSP65上与动脉粥样硬化密切相关的6个B细胞表位基因。将这6个表位的基因分成两组,分别与CTB基因相融合并在大肠杆菌中表达。两种蛋白表达产物经过分离、纯化、混合复性,复性后的蛋白经GM1-ELISA证明可在体外自组装成5聚体。用复性后的重组蛋白小剂量多次滴鼻免疫ICR小鼠,然后用大量的HSP65蛋白经皮下免疫,采集血样,ELISA检测小鼠血清中抗HSP65的抗体。结果:重组蛋白预免疫ICR小鼠后,可以使免疫组较对照组对随后的大量HSP65刺激产生更加强烈的免疫反应。结论:分枝杆菌热休克蛋白保守性B细胞表位经鼻黏膜的反复预免疫强化了小鼠对随后攻击性免疫的反应。     

猪鼻支原体攻毒模型研究进展

猪鼻支原体是第一种从猪体内分离到的病原体,可引起猪的肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎等临床症状,对养殖业造成巨大危害。同时证实其与多种人类肿瘤有明显的相关性,也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物。目前对猪鼻支原体的预防较为困难,暂无理想的抗生素和疫苗。猪鼻支原体攻毒模型是进行致病机理、疫苗评价及药物等研究的基础。本文就目前猪鼻支原体常用攻毒模型的研究进展进行综述。     

分支杆菌热休克蛋白保守性B细胞表位经鼻粘膜的反复预免疫对随后攻击性免疫的强化作用

为了研究热休克蛋白65与动脉粥样硬化的关系,扩增出HSP65上与动脉粥样硬化密切相关的6个B细胞表位.将这6个表位分成两组,每组包含3个表位.其基因分别与CTB基因相融合,转化到大肠杆菌并表达蛋白.表达产物经过一系列的分离纯化步骤,并复性后经GM1-ELISA证明可在体外自组装成五聚体.用复性后的重组蛋白小剂量多次滴鼻免疫ICR小鼠.随后用大量的HSP65蛋白皮下免疫,ELISA检测小鼠血清中抗HSP65的抗体.初步药效学实验表明.重组蛋白预免疫ICR小鼠后,可以使免疫组较对照组对随后的大量HSP65刺激产生更加强烈的免疫反应.     

猪鼻支原体vlp重复区融合蛋白的构建表达及反应原性分析

目的 猪鼻支原体(Mhr)是临床猪场常见病原菌之一,同时研究证实其与多种人类肿瘤有关。目前对Mhr的血清学检测尚无有效的方法。本研究以Mhr可变脂蛋白(vlp)家族为对象,设计vlp家族蛋白重复区片段融合蛋白,以作为检测用包被抗原使用。方法 根据大肠杆菌的密码子偏嗜性,设计并构建串联表达7种Mhr可变脂蛋白vlpA、B、C、D、E、F、G重复区片段的重组蛋白vlpA-G基因。将该基因片段装入pET-32a(+)载体中转化大肠杆菌,筛选鉴定获得阳性工程菌。IPTG诱导表达,镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白vlpA-G。Western Blot鉴定该重组蛋白与Mhr阳性血清的反应能力,并利用该重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA方法用于检测猪血清中的Mhr抗体。结果 构建表达vlpA-G重组蛋白的基因工程菌,经PCR及DNA测序正确。IPTG诱导后出现明显蛋白条带,经镍柱亲和层析纯化获得vlpA-G重组蛋白。Western Blot试验证明重组蛋白vlpA-G能够和Mhr阳性兔血清产生明显的阳性杂交带;利用重组vlpA-G为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法可成功检测Mhr阳性猪血清,证明该重组vlpA-G蛋白具有良好的反应原性。结论 本研究构建了重组蛋白vlpA-G并证实该蛋白具有良好的反应原性,可作为Mhr血清学诊断方法研究的候选抗原,同时也为Mhr重组蛋白疫苗提供可选抗原。     

猪鼻支原体的流行特点及防治措施

猪鼻支原体在世界各地的猪群中普遍流行,近年来由猪鼻支原体引发的临床病例愈发常见,威胁养猪业的健康发展。猪鼻支原体也被报道与人类的多种癌症之间存在联系,具有潜在的公共卫生威胁。随着抗生素的长期使用,猪鼻支原体的耐药性问题也逐渐显现,大大降低了抗生素的临床治疗效果。鉴于猪鼻支原体的防控需要,本文对猪鼻支原体的流行特征、发病特点、致病机制、耐药性和防治措施加以综述,以期为猪鼻支原体的基础研究和临床防控提供参考。     

霍乱毒素B亚单位与p277融合基因在大肠杆菌中表达及免疫分析

为了增强多肽表位的免疫原性,构建了霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)和p277的融合基因CTB-p277,将该融合基因克隆到pET28a( )中,获得原核表达载体pET28a-CTB-p277;并将该质粒转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中;重组菌株经2%的乳糖诱导5 h后的表达产物用12%的SDS-PAGE分析表明可以表达融合蛋白,融合蛋白占全菌蛋白约40%,且主要以包含体的形式存在。包含体经洗涤、裂解,用DEAE纤维素离子交换纯化,可以获得99.1%的重组蛋白。重组蛋白的包含体经复性后,在体外可以自组装成五聚体。重组蛋白免疫KK-Ay小鼠后,ELISA的分析表明可以产生抗p277的抗体。血糖和体重的测定结果显示,给药组小鼠的血糖有明显的降低,体重也有相应的减轻。同时GM1-ELISA的检测表明,CTB-p277在体外可以和神经节苷脂GM1(Monosialoganglioside)特异结合,具有生物活性。     

猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立

目的 猪鼻支原体是临床猪场的常见病菌,可引起猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、中耳炎等慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤有明显相关性,但其致病机理有待深入,其感染细胞机制的研究尚未明确,因此,本研究欲建立一种用间接免疫荧光技术检测猪鼻支原体黏附宿主细胞的方法。方法 以猪鼻支原体和猪肾上皮细胞为研究对象,以兔抗猪鼻支原体纯化抗体为一抗,以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立猪鼻支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法(IFA)。结果 最终确定最小黏附滴度为1∶10⁷ CCU/mL,猪鼻支原体黏附PK15所需时间为6 h以上,一抗的最佳工作浓度为1∶100,二抗的最佳工作浓度为1∶1 600。结论 表明间接免疫荧光技术可以用来检测猪鼻支原体对宿主细胞的黏附作用。为猪鼻支原体的研究特别是感染细胞机制的体外研究提供基础方法,同时为疾病的诊断及疫苗的研发奠定基础。     

霍乱毒素B亚单位与胰岛素B链结构类似多肽融合蛋白的制备

为了在大肠杆菌中表达霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)与胰岛素B链(9-23)肽段结构类似多肽(Ins B(9-23))的融合蛋白,使用基因工程方法构建了CTB与Ins B(9-23)的融合基因CTB-Ins B-X若干,并将融合基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组菌株经乳糖诱导后,其表达产物经过12%SDS-PAGE分析表明该菌株可以包含体形式表达融合蛋白,并制备得到纯度较高的重组蛋白。该重组蛋白的包含体经过变性、复性后,可以在体外自组装成五聚体结构。GM1-ELISA分析结果表明,重组蛋白在体外可以与神经节苷脂GM1(monosialoganglioside)特异性结合,表明该融合蛋白保持了CTB形成五聚体的生物活性。