大鼠胚胎胰腺发育后期基因表达谱的研究

目的：研究大鼠胚胎发育至第15.5和18.5天胰腺基因表达谱,探讨特异性基因表达在正常内外分泌胰腺发育及糖尿病中所起的作用.方法：①实验于2003-09/2004-06在南京医科大学生化与分子生物学实验室完成.选用SD大鼠,雌雄各10只,将雌雄鼠按1：2合笼,分别于胚胎发育至第15.5和18.5天,剖腹取出孕子宫,分离胚胎.②应用显微分离及提取技术获得胚胎发育不同阶段胰腺组织并提取RNA,采用高密度寡核苷酸芯片（Affemetrix芯片）对胚胎发育至第15.5天和第18.5胚胎胰腺进行基因转录水平分析,用生物信息学方法分析具体基因的表达情况.结果：胚胎发育至第18.5天与胚胎发育至第15.5天相比,差异表达2倍以上的基因共1 319条.其中表达上升的基因664条,表达下降的基因655条,功能已知基因占63%,表达序列标识占37%.控制胰腺细胞分化的转录因子明显下调,与功能代谢相关的转录因子有上升趋势,内外分泌酶类、激素类表达有上升趋势,骨架蛋白有下降趋势,与激素、酶类分泌相关的因子基本无表达.结论：大鼠胚胎胰腺发育至第15.5～18.5天,内分泌典型胰岛结构及外分泌腺泡、导管结构已基本形成,功能细胞分化基因表达下降,而细胞代谢调节功能基因表达上升,因此,在大鼠胚胎发育至第15.5天胰腺,功能细胞的代谢调节功能开始完善.     

ETS1对非洲爪蛙早期胚胎发育的影响

目的:通过在非洲爪蛙胚胎中过表达ETS1探讨该基因对爪蛙胚胎早期发育的影响?方法:将克隆PCR获得的ETS1全长片段连接到质粒上,获得pCS2+-ETS1质粒;利用RT-PCR和Western blot检测ETS1 mRNA和蛋白在胚胎发育不同时期的表达情况;显微注射ETS1 mRNA入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交?定量PCR检测胚层标志性基因的表达;通过Western blot检测过表达ETS1对细胞凋亡和增殖的影响?结果:ETS1从受精卵时期即已开始表达,在器官形成期表达增强,过表达ETS1抑制了细胞分化以及神经胚期中胚层和外胚层标志基因表达,凋亡相关蛋白表达增加,增殖相关蛋白无明显变化?结论:ETS1表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,过表达ETS1抑制了中胚层和外胚层发育,促进细胞凋亡但不影响细胞增殖?     

生物化学实验教学中因专业施教的探讨

随着医学教学改革的深入与细化,如何针对不同专业的医学生调整生物化学实验的教学设计与教学方式,已成为目前改革中不得不思考的问题.对于临床专业的学生,教师应将教学与临床结合,加深学生对生物化学内容的学习与掌握,并了解如何运用这些知识.而对于基础专业的学生,则应重点培养他们的科研能力.     

α2A-肾上腺素能受体基因调控区单核苷酸多态性对基因转录活性的影响

[目的]探讨α_(2A)-肾上腺素能受体基因-1296位单核苷酸多态性对受体基因转录活性的影响。[方法]以基因组 DNA为模板,扩增α_(2A)-肾上腺素能受体基因 5’侧翼序列(2 085 bp),-1296位分别为g或c,与报告基因载体pGL3-enhancer相连接,构建重组载体,分别与pRL-CMV共转染人绒癌细胞JEG-3,检测荧光素酶相对表达量。[结果]成功构建重组质粒 pGL3FSg/pGL3FSc,荧光素酶检测结果显示,当5侧翼-1296位为g时,荧光素酶基因表达量高,而为c时,荧光素酶基因表达量低。[结论]a_(2A)-肾上腺素能受体基因5’侧翼-1296位为g时,基因转录活性较高;为c时,基因转录活性较低。     

条件性胰岛β细胞CASK基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的：构建条件性胰岛β细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin?dependent serine protein kinase,CASK）基因敲除小鼠,为研究CASK基因在糖尿病发生中的机制提供动物模型。方法：将CASKloxp/- 雌鼠与CASKloxp/Y雄鼠杂交,获得基因型为CASKloxp/loxp雌鼠、CASKloxp/Y雄鼠;再让条件性胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶雄鼠与CASKloxp/loxp雌鼠杂交获得CASKloxP/YMIP?Cre雄鼠和CASKloxP/-MIP?Cre雌鼠。CASKloxP/YMIP?Cre基因型小鼠即为本实验所需要构建的模型小鼠。小鼠生后1~2周剪尾,通过PCR鉴定小鼠基因型,4~5周龄时腹腔注射他莫昔芬诱导Cre重组酶表达后,利用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹技术验证CASK基因敲除效果。结果：从引进这两种小鼠开始,繁殖10个月,共获得基因型为CASKloxP/YMIP?Cre的雄鼠28只,PCR 结果证实小鼠基因型符合CASKloxP/YMIP?Cre。实时荧光定量PCR、蛋白质印迹结果显示CASKloxP/YMIP?Cre小鼠胰岛CASK表达量明显下降。结论：利用 Cre/loxp系统,成功构建了条件性胰岛β细胞CASK基因敲除小鼠,为在动物水平研究CASK基因在糖尿病发病机制中的作用提供了研究平台。     

ETS1/2对非洲爪蛙胰腺发育的影响

目的：探讨ETS1/2对非洲爪蛙胚胎胰腺发育的影响。方法：设计并合成特异性抑制ETS1/2表达的反义吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonueleitide,MO),通过显微注射的方法将MO转入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交和定量RT-PCR检测标志性基因的表达变化。结果：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,共同敲降ETS1/2后会使爪蛙胚胎发育异常,胰腺标志基因表达上升,肠道标志基因表达下降,肝脏和胃标志基因无明显变化;胰腺标志基因ngn3、igf1、foxa1的启动子区存在ETS1/2的结合位点。结论：单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,敲降ETS1/2促进爪蛙胚胎胰腺发育,抑制肠道发育,对肝脏和胃的发育无明显影响。     

多媒体教学在生物化学教学中的应用

计算机与基础教育的结合是世界范围内教育改革的一大趋势。在生物化学的基础教学中引入了多媒体教学手段，在取得良好教学效果的同时，与传统教学做了初步的对比研究。     

青年教师进行生物化学教学的体会

青年教师具有科研能力较强、容易获得学生认同、具有较强的可塑性等优势,同时又存在缺乏对教材的整体把握以及缺乏教学技巧和教学经验等不足之处。在教学过程中充分发挥现有的优势,同时注意弥补不足,将有助于生物化学教学质量的提高。     

大鼠INS-1细胞中IGFBP-2 mRNA的表达调控

目的:研究大鼠胰腺肿瘤β-细胞(INS-1)中,葡萄糖(Glucose)、胰岛素(Insulin)和生长激素(GH)对胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP-2)基因的表达调控,探索IGFBP-2基因调节机制及其在维持正常胰腺细胞生理功能中的作用.方法:RNA印迹法(Northern blotting)检测INS-1细胞IGFBP-2 mRNA的表达,酶标法测定INS-1细胞胰岛素分泌量.结果:葡萄糖对IGFBP-2 mRNA调节作用不同;高浓度(10mmol/L)葡萄糖条件下,胰岛素分泌量增加,而IGFBP-2mRNA表达被抑制;低浓度(1～5.6 mmol/L)葡萄糖条件下,胰岛素分泌量无显著性变化,IGFBP-2 mRNA正常表达.INS-1细胞在不完全培养液中,加入GH培养,在不同时间间隔提取培养液进行IGFBP-2 mRNA检测,结果发现,培养16 h以上,IGFBP-2 mRNA表达开始显著下降.外源胰岛素抑制IGFBP-2 mRNA的表达.结论:葡萄糖和生长激素对INS-1细胞中IGFBP-2 mRNA表达的抑制作用是通过胰岛素调控的.     

XBP1在非洲爪蟾胚胎发育中的作用

目的：探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1)对非洲爪蟾胰腺发育的影响。方法：利用western blot,原位杂交和免疫染色方法检测XBP1在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用RT-PCR和整体胚胎原位杂交方法检测基因表达变化。结果：XBP1主要表达于非洲爪蟾胚胎发育中的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降XBP1s在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论：XBP1s在胚胎发育早期影响胚层形成,在晚期影响胰腺的发育。