沉香DNA的提取及其ITS2-PCR体系的优化

目的:建立沉香的总DNA提取方法及r DNA第二内转录间隔区序列(ITS2)聚合酶链式反应(PCR)扩增体系。方法:分别采用改良的CTAB法、改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法及DNA提取试剂盒法提取沉香总DNA,利用通用引物ITS2P1/ITS2P2扩增r DNA ITS2目的片段,通过正交试验优选沉香的PCR扩增条件并对目的片段进行测序。结果:改良的CTAB法联合DNA提取试剂盒法提取总DNA的A260 nm/A280 nm1.79,质量浓度350 mg·L-1,PCR扩增目的片段产率最高。不同因素水平对沉香ITS2-PCR反应的影响顺序为模板DNA引物Taq DNA聚合酶d NTP。最佳反应体系为20μL体系,DNA模板40 ng,引物0.2 mmol·L-1,d NTP 0.5 mmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.5 U。测序获得的目前片段长度230 bp,与Gen Bank中瑞香科沉香属白木香序列相似性100%。结论:CTAB法联合DNA试剂盒法可简单、快速获得高质量沉香总DNA,正交试验可快速获得ITS2目的片段,为沉香的分子鉴定和系统发育分析提供参考。     

白木香倍半萜合成酶As-SesTPS1基因的克隆、生物信息学和表达分析

目的基于前期对白木香Aquilaria sinensis转录组测序结果,从白木香总RNA中克隆白木香倍半萜合成酶基因(As-Ses TPS1),并对其进行生物信息学及表达分析。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从白木香总RNA中获得倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1的c DNA全长序列;利用生物信息学手段对该序列进行相似性和同源性分析,并预测其编码蛋白的结构和功能;利用q RT-PCR技术检测该基因在白木香不同样品中的表达水平。结果得到倍半萜合成酶基因As-Ses TPS1,开放阅读框(ORF)全长1 671 bp,编码556个氨基酸,其与多条倍半萜合成酶基因具有较高相似性,并含有RRx8W和DDxx D的保守序列;该基因在白木香的沉香样品中高表达。结论 As-Ses TPS1的克隆及其生物信息学和在白木香不同部位表达差异性分析,为白木香倍半萜生物合成代谢途径的研究奠定基础。     

深海真菌Phomopsis tersa的次级代谢产物及其细胞毒活性研究

目的 研究深海真菌Phomopsis tersa FS441的次级代谢产物及其细胞毒活性。方法 采用正、反相硅胶柱、凝胶柱和高效液相等多种色谱技术对菌株FS441的固体发酵产物进行分离纯化,并通过NMR、MS等波谱方法鉴定化合物结构,采用SRB法对得到的单体化合物进行细胞毒活性测试。结果 从发酵物中分离纯化得到11个化合物,分别鉴定为：5α, 8α-表二氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇（1）、麦角甾醇（2）、12-hydroxydehydrobotrydienol（3）、5,6-二羟基-2,3,6-三甲基环己-2-烯酮（4）、1,2-二羟基-3,4-脱氢蒽酮（5）、（1S,2S,3S,4R） -3-氯-4-（2-羟基丙吡啶-2-基）-1-甲基环己烷-1,2-二醇（6）、（-）-5-methylmellein（7）、酪醇（8）、胸腺嘧啶核苷（9）、（R）-（+）-甘油1-9 （Z）,12 （Z）-十八碳二烯酸酯（10）、亚油酸（11）。结论 化合物3～6为首次从Phomopsis属分离得到,化合物1和2对SF-268、MCF-7、HepG-2和A549 4种肿瘤细胞株具有弱的细胞毒活性。     

稻黑孢霉A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物分析

目的:分析稻黑孢霉(Nigrospora oryzae)A8及其诱导的人工沉香次生代谢产物。方法:三氯甲烷萃取白木香内生真菌及其诱导的人工沉香,气相-质谱联用法(GC-MS)分析代谢产物,自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)结合保留指数(RI)法鉴定挥发性成分。结果:N.oryzae A8发酵液共检出58个色谱峰,鉴定其中30种化合物,检出相对含量最高的化合物是β-苯乙醇;N.oryzae A8人工诱导白木香生产的3批沉香药材共鉴定出38种化合物,主要为倍半萜类、芳香族类、2-(2-苯乙基)色酮类等沉香特征性成分。结论:N.oryzae A8发酵液可高效诱导白木香结香,其次生代谢产物可能参与沉香形成过程。     

沉香挥发性成分与其抗肿瘤活性的灰色关联度分析

目的对沉香挥发性成分与其体外抗肿瘤活性进行灰色关联度分析。方法 GC-MS法分析4种沉香三氯甲烷提取物的挥发性成分,磺酰罗丹明B(SRB)比色法测定其对Hep G-2、SF-268、MCF-7、NCI-H460细胞株的IC50,再通过灰色关联度分析成分峰面积相对含有量与相应IC50的相关性。结果沉香挥发性成分主要有倍半萜、色酮、甾体,对4种肿瘤细胞株的IC50在11.11~58.55μg/m L之间。与抗肿瘤活性关联度大于0.70的18个挥发性成分中,有6个2-(2-苯乙基)色酮、3个甾体、8个倍半萜。保留时间202.3 min的2-(2-苯乙基)色酮和豆固酮表现出较强的抗肿瘤活性,与4种肿瘤细胞株的IC50关联度均在0.8以上。结论沉香挥发性成分中的2-(2-苯乙基)色酮化合物在其抗肿瘤活性方面具有重要的作用。     

西藏冬虫夏草水提液HPLC指纹图谱研究及核苷类成分测定

目的建立西藏不同产区27批冬虫夏草水提液的高效液相色谱指纹图谱,并定量测定其6种主要核苷类成分（尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2＇-脱氧腺苷）的质量分数。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent Eclipse XDB—C18柱（250mm×4．6mm,5μm）,检测波长260nm,以甲醇．水为流动相进行梯度洗脱,柱温25℃,流速O．8mL·min^-1。结果建立了冬虫夏草水提液的HPLC指纹图谱,包含11个共有峰,各峰分离良好,指认出尿苷、肌苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2’-脱氧腺苷6个特征成分．同时测定了其质量分数;6种特征成分质量浓度分别在10．71-96．4（r=0．9999）,8．50～76．41（r：0．9999）。7．838-70．54（r=0．9999）,1．120-10．08（r=0．9998）,5．715-51．44（1-=0．9999）,0．2625～2．363μg·mL^-1（r=0．9997）范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率依次为96．5％、97．7％、97．5％、95．2％、96．8％、101．5％,RSD分别为2．3％、2．7％、2．0％、2．6％、3．0％、2．7％（n=6）。结论本试验建立的指纹图谱可同时对冬虫夏草的6种主要核苷类成分进行分析,对评价藏产冬虫夏草的质量具有重要意义。     

HPLC法测定西藏主产区冬虫夏草中尿苷和腺苷的含量

目的 建立HPLC法同时测定西藏产冬虫夏草中尿苷及腺苷的含量.方法 采用Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm,5 μm)色谱柱,检测波长260 nm,以甲醇-水为流动相梯度洗脱,流速1.0mL/min,柱温33℃.结果 尿苷和腺苷分别在32.95～439.3 μg/mL(r =...     

广藿香内生真菌撕裂耙齿菌A878次级代谢产物研究

目的 研究药用植物广藿香Pogostemon cablin内生真菌撕裂耙齿菌Irpex laceratus A878的活性次级代谢产物。方法 运用硅胶、Sephadex LH-20、HPLC等多种柱色谱技术以及重结晶方法对发酵产物进行分离纯化,并利用¹H-和¹³C-NMR、UV等谱学方法鉴定化合物结构。采用SRB法和Griess法测定化合物的生物活性。结果 从广藿香内生真菌撕裂耙齿菌A878固体发酵产物中分离鉴定了2个新化合物和10个已知化合物。分别为撕裂耙齿菌内酯A(1)、撕裂耙齿菌内酯B(2)、细胞松弛素H(3)、细胞松弛素J(4)、18-甲氧基细胞松弛素J(5)、去乙酰基细胞松弛素H(6)、细胞松弛素J₃(7)、拟茎点霉(口山)酮A(8)、狄瑟酚A(9)、桔青霉三酚A(10)、(22E,24R)-麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(11)和1S,2R,4S-三羟基-对-薄荷烷(12)。结论 化合物1、2为新的吡喃内酯类化合物。活性研究表明化合物4、5和9对人神经癌SF-268细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人肝癌H...     

沉香中苄基丙酮与浸出物含量相关性研究

目的:研究白木香结香过程中苄基丙酮与浸出物含量(%)之间的相关性。方法:采用气相色谱法测定样品中苄基丙酮含量。按中国药典(2010年版)一部沉香鉴别项下相关要求测定样品醇溶性浸出物的含量,并进行理化鉴别;应用"小孔滴注法"进行人工造香试验。结果:苄基丙酮浓度在5.780～104.0μg/mL(r=0.9997)及0.07500～28.20μg/mL(r=0.9995)范围内有良好的线性关系;加样回收率为99.9%～101.6%(n=6),RSD=0.65%。沉香商品药材中苄基丙酮与浸出物含量之间不呈正比关系。随着人工造香时间的增加,有些白木香结香部位的醇溶性浸出物和苄基丙酮含量均呈增加趋势;有些白木香结香部位醇溶性浸出物含量增加,而苄基丙酮含量呈下降趋势。结论:气相色谱法测定沉香中苄基丙酮含量操作简便,测定结果准确、重复性好;"小孔滴注法"人工造香技术快速可行,为沉香形成机理研究提供基础。     

纤维堆囊菌的次级代谢产物及其活性研究概况

 目的 对纤维堆囊菌次级代谢产物及其生物活性进行综述。方法 以国内外发表的文献为依据,根据代谢产物的结构类型对1977~2009年间已发表的纤维堆囊菌的次级代谢产物及其生物活性进行综述。结果 纤维堆囊菌 (Sorangium cellulosum)能产生大量结构新颖、生物活性多样的次级代谢产物,部分已在临床上得到应用。结论 在我国开展纤维堆囊菌活性代谢产物的研究具有巨大的潜力。