15-脂氧化酶-1分子酶学研究进展

人们一直认为哺乳动物体内没有脂氧化酶（LOX）,直到1975年Schewe H等人发现兔网织细胞中含有一种LOX,它能催化花生四烯酸15-C加氧,遂命名为网织细胞型15-LOX（reticulocyte—type 15～lipoxygenase）,也曾用过15 lipoxygemse reficulocyte arachidonate等名字。由于这种15-LOX不仅仅存在于网织细胞,在其他多种组织细胞也存在,并且又发现了同工酶,因此现更多使用15-LOX-1指代网织细胞型15-LOX,但不少学者仍习惯使用15-LO、15-LOX等名字。     

MT2-MMP在Ⅱ期肺腺癌中的表达及临床意义

目的 探讨MT2-MMP在肺腺癌患者组织中的表达情况及其临床意义。方法 收集40例病理TNM分期Ⅱ期的肺腺癌组织标本,其癌旁正常组织为对照组,进行HE染色,免疫组织化学方法检测MT2-MMP的表达进行半定量分析;应用卡方检验分析MT2-MMP表达与临床病理特征的关系;结合TCGA肺腺癌数据分析MT2-MMP在肺腺癌中的表达情况。结果 肺腺癌组织呈现明显的肿瘤无序增殖病理特征;MT2-MMP在肺腺癌中表达高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P＜0.001);肺腺癌组织中的MT2-MMP的表达水平与患者的肿瘤大小有关(P＜0.01),而与性别、年龄、是否有淋巴转移无明显相关(P＞0.05);TCGA大数据分析结果显示肺腺癌Ⅱ期及其他各期MT2-MMP的表达均显著高于正常组织,差异具有统计学意义(P＜0.01)。结论 MT2-MMP在Ⅱ期肺腺癌组织中呈高表达,可能参与肺腺癌早期的恶性进展,对肺腺癌的早期诊断具有潜在价值。     

15-脂氧酶-1基因表达调节研究进展

15-脂氧酶-1（15-LOX-1）是脂质过氧化物酶，分别以亚油酸、花生四烯酸为底物氧化生成13-羟基-十八碳二烯酸（13-HODE）、15-羟基-二十碳四烯酸（15-HETE）。15-LOX-1基因表达在转录、翻译、翻译后修饰各个水平都受到多种因素的调节，影响着15-LOX-1的表达量和酶催化活性。本文就15-LOX-1转录、翻译、翻译后修饰各个环节的调节因素作一简要介绍。     

15-HETE对肺动脉内皮细胞一氧化氮合酶苏氨酸495位点（eNOS Thr495）磷酸化的影响

目的： 探讨15-羟化二十烷四烯酸（15-HETE）对肺动脉内皮细胞（pulmanory artery endothelial cells, PAECs）一氧化氮合酶（endothelia nitric oxide synthase, eNOS）活性的影响。 方法： 通过测定大鼠离体肺动脉环张力，比较去血管内皮、eNOS抑制剂L-NAME对15-HETE收缩肺动脉的影响；通过免疫沉淀和免疫印迹方法测定牛PAECs经2×10-6 mol/L 15-HETE作用后，eNOS Thr 495磷酸化情况；用免疫印迹方法测定15-HETE对牛PAECs eNOS总蛋白表达的影响；用Greiss法检测15-HETE及15-脂氧酶（15-LO）抑制剂CDC和NDGA对牛肺动脉内皮细胞一氧化氮（NO）产量的影响。 结果： (1)除去肺动脉内皮后, 15-HETE收缩血管作用明显增强（P＜0.01）。（2）抑制剂L-NAME 10-4 mol/L 可使15-HETE收缩肺动脉的作用明显增强（P＜0.05）。(3)牛PAECs经2×10-6 mol/L 15-HETE作用后，eNOS Thr 495位点磷酸化水平增强（P＜0.01）。（4）10-6 mol/L 15-HETE可抑制亚硝酸盐（NO-2/NO-3）的产生(P＜0.05)，抑制内源性15-HETE可明显增加NO-2/NO-3的产量，和对照组相比 10-5 mol/L CDC组P＜0.05，10-4 mol/L NDGA组P＜0.01。 结论： 肺动脉内皮细胞eNOS/NO通路参与抑制15-HETE收缩大鼠肺动脉，15-HETE抑制肺动脉内皮细胞eNOS活性，使NO产量（NO-2/NO-3）下降。     

血红素抑制内皮细胞损伤的形态学观察

目的 探讨血红素对人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用。方法 将培养的人脐静脉内皮细胞进行分组：对照组、损伤组、血红素组。观察各组细胞在光、电镜下形态学的改变。结果 在光镜下，血红素组细胞的生长状态明显优于损伤组；在电镜下，损伤组细胞核固缩，而血红素组细胞核幼稚，核仁明显。结论 在人脐静脉内皮细胞中，血红素对过氧化氢所造成的氧化应激损伤有明显的保护作用。     

ERK1/2通路在4-AP诱导大鼠肺动脉收缩中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶-1/2(ERK1/2)通路在4-氨基吡啶(4-aminopyridione,4-AP)阻断正常大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)膜上电压依赖性钾通道(KV)所引起的肺动脉收缩中的作用。方法取正常鼠肺动脉制作肺动脉环,分别加入4-AP(KV通道阻断剂),PD98059/U0126+4-AP,比较肺动脉收缩的变化。同时培养肺动脉平滑肌细胞进行Western blot分析4-AP对ERK1/2的影响。结果①在血管环试验中,4-AP引起的肺动脉收缩有浓度依赖性;加入20mmol.L-1PD98059或2μmol.L-1U0126可以抑制4-AP引起的肺动脉收缩。②4-AP可刺激PASMCs ERK1/2蛋白磷酸化;③U0126可抑制4-AP引起的ERK1/2蛋白磷酸化。结论ERK1/2通路参与4-AP阻断正常大鼠肺动脉平滑肌细胞膜上电压依赖性钾通道(KV)引起肺动脉收缩。     

Kv通道亚型在15-HETE收缩肺动脉过程中的作用

目的从组织功能及细胞分子水平研究电压门控型钾通道(Kv通道)亚型在15-羟化二十碳四烯酸(15-HETE)致大鼠肺动脉收缩过程中的作用。方法采用组织浴槽血管环法，使用Kv通道阻断剂，确定受15-HETE调控大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)膜上Kv亚型；使用RT-PCR和Western blotting技术观察受15-HETE调控PASMCs 膜上Kv亚型。结果阻断Kv1.1，Kv1.2，Kv1.3和Kv1.6通道并不影响15-HETE诱导肺动脉血管收缩；15-HETE不影响PASMCs膜上Kv1.1和Kv1.2通道蛋白质表达；15-HETE下调PASMCs膜上Kv1.5和Kv2.1通道mRNA和蛋白质表达。结论缺氧可能是通过15-HETE这一介导因子抑制Kv1.5和Kv2.1通道，减少PASMCs膜上功能性Kv1.5和Kv2.1通道数量，导致PASMCs收缩。     

大鼠肾胆绿素还原酶 cDNA克隆、表达及鉴定

目的克隆大鼠肾胆绿素还原酶(BVR)的cDNA序列后在大肠杆菌中表达、纯化并进行鉴定.方法采用RT-PCR方法利用设计合成的一对特异性引物从大鼠肾组织扩增BVR的cDNA序列,构建pMW172a-BVR重组质粒,转化扩增后进行序列测定,证实同GenBank [053850]公布的大鼠肾BVR的cDNA序列相同后,阳性重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中表达并进行纯化.结果 SDS-PAGE鉴定其分子量为33 ku,分光光度仪检测具有催化胆绿素还原为胆红素的活性,证实为胆绿素还原酶.实验还测定了Km值,以NADH和NADPH分别作供氢体,测得Km值分别是380 μmol/L、3.5 μmol/L.结论通过克隆表达获得了有活性的大鼠BVR酶蛋白,为进一步研究BVR的性质及功能奠定了基础,也为血红素加氧酶的研究提供了便利条件.     

重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中表达和纯化方法的研究

目的　确定重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中的表达条件及纯化方法。方法　将已构建的大鼠肾胆绿素还原酶 (BVR)的重组质粒pMW172a -BVR转入大肠杆菌BL - 2 1,分析不同温度、摇床转速对BVR表达的影响 ,确定可溶性表达最佳条件。使用超速离心、盐析、层析的方法纯化BVR。检测酶活性。结果　确定了BVR可溶性表达最佳条件为 37℃ (12 0± 5 )r/min ;确定了BVR具体纯化路线。所得蛋白纯度为 92 2 %、纯化倍数为 4 3倍、回收率为 19 8%的活性BVR蛋白。结论　获得了纯度高、具有活性的BVR蛋白 ,可作为工具酶用于某些相关酶的研究 ,也为进一步进行BVR结构与功能之间关系的研究提供了可行的纯化路线     

15-羟基二十碳四烯酸收缩慢性缺氧动脉环信号转导通路的部位：内皮细胞还是平滑肌

目的:观察15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)致慢性缺氧性大鼠肺动脉收缩的信号转导途径,阐明15-羟基二十碳四烯酸引起慢性缺氧性肺动脉收缩作用的可能机制。方法:实验于2006-03/2006-09在哈尔滨医科大学药学院进行。①实验材料:健康成年雄性Wistar大鼠,体质量220～240g,清洁级,由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。②实验方法:取18只成年雄性Wistar大鼠连续缺氧9d(O2体积分数为0.12)制作大鼠缺氧模型,通过氧气监测控制器控制箱内氧气体积分数为0.12,9d后即成为缺氧大鼠模型。16只正常大鼠吸入正常空气(O2体积分数为0.21)作为对照。将大鼠麻醉后分离直径1.5mm肺内动脉,剪成2mm长动脉环置于组织浴槽中,记录血管张力变化。③实验评估:观察15-羟基二十碳四烯酸对缺氧模型组、正常组大鼠血管收缩作用,在此基础上,除去血管内皮细胞和使用丝裂素活化蛋白激酶的激酶抑制剂PD98059,明确血管内皮细胞和丝裂素活化蛋白激酶的激酶系统在15-羟基二十碳四烯酸收缩肺动脉中的作用。结果:34只大鼠均进入结果分析。①15-羟基二十碳四烯酸对正常组、缺氧模型组大鼠血管环均有收缩作用,呈浓度-效应正相关,但缺氧组收缩明显,与正常组比较,差异显著(P<0.01)。②丝裂素活化蛋白激酶的激酶抑制剂PD98059可明显阻断15-羟基二十碳四烯酸对缺氧大鼠肺动脉的收缩作用(P<0.05)。③去掉内皮的缺氧大鼠肺动脉,PD98059仍明显阻断15-羟基二十碳四烯酸的收缩作用(P<0.05)。结论:15-羟基二十碳四烯酸通过激活肺动脉平滑肌丝裂素活化蛋白激酶的激酶信号转导途径收缩慢性缺氧性大鼠肺动脉,作用部位主要位于血管平滑肌。