红花昼夜节律相关基因CtPRR1的特征及功能研究

目的探究昼夜节律基因对红花黄酮类物质生物合成的影响及机制。方法基于红花花冠转录组及代谢组数据库筛选潜在调控红花黄酮类化合物生物合成的昼夜节律基因;用qPCR测定红花各部位以及花冠单日不同时间点昼夜节律基因的表达量,液质联用测定黄酮类化合物的积累量,并分析二者的相关性;酵母双杂交实验验证昼夜节律基因的互作蛋白。结果获得7个昼夜节律基因PRR1、PRR2、ELF3、FT、PHYB、GI、ZTL,其中PRR1基因与黄酮类化合物积累量呈正相关(r≥0.7)。PRR1全长3201 bp,编码421个氨基酸,与水稻OsPRR73基因高度同源,将其命名为CtPRR1(GenBank登录号:MW492035)。CtPRR1主要在花中表达,表达量在日间逐渐升高,晚间逐渐下降;黄酮类化合物芹菜素、槲皮素、HSYA、山奈酚、Carthamin、山奈酚-3-O-葡萄糖苷以及野黄芩素的含量为白天逐渐降低,晚间逐渐升高,二者都有昼夜节律性且呈负相关(r≥?0.7)。酵母双杂实验得到2个热休克蛋白、3个AP2转录因子。结论CtPRR1对红花黄酮类成分的昼夜节律性积累起负调节作用;CtPRR1可能受这些互作蛋白的影响调控红花黄酮类成分的昼夜节律性积累。     

羟基红花黄色素A生物合成途径短链还原酶基因的特征及功能研究

目的 探究参与红花黄酮类生物合成途径特别是羟基红花黄色素A（HSYA）关键短链脱氢还原酶基因（SDRs）的功能。方法 基于红花转录组数据库以及代谢组数据库,筛选参与HSYA生物合成途径的SDRs,用qRT-PCR法分析表达模式。采用无缝克隆技术构建过表达载体,以农杆菌GV3101介导遗传转化云南巍山红花品系,对转基因T₂代植株进行阳性验证,并对花冠SDRs的基因表达量进行分析,UPLC-Q-TOF/MS法测定次生代谢物的含量。结果 筛选出3个参与HSYA生物合成途径的关键短链脱氢还原酶基因CtSDR1、CtSDR2、CtSDR3,表达量从高到低依次为花冠>叶>茎>根。花冠中表达量随花冠发育逐渐升高。对转基因T₂代植株进行阳性验证后的花冠进行qRT-PCR分析发现：与空白对照组相比,转CtSDR3过表达T₂代阳性植株花冠中CtSDR3基因的转录水平增加了2~3倍,次生代谢物HSYA的含量提高了7.1%～16.6%（P＜0.05）。结论 CtSDR3可能参与了红花中黄酮类化合物特别是HSYA的生物合成,为阐释CtSDR3在HSYA生物合成途径中的功能提供了数据支撑。     

木香挥发油诱导人白血病细胞MV4-11凋亡及其作用机制的探讨

目的:以人急性髓性白血病MV4-11细胞为研究对象,探讨木香挥发油对MV4-11细胞增殖与凋亡抑制作用及其作用机制。方法:以质量浓度分别为3,6,12,25,50,100 mg·L~(-1)的木香挥发油作用于人急性髓性白血病MV4-11细胞不同时间,另设空白组,采用噻唑蓝(MTT)法检测木香挥发油对其增殖抑制作用,Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态学变化,Annexin V-FITC,PI双染及PI单染法应用流式细胞术检测细胞凋亡和周期,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测蛋白激酶B(AKT),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)凋亡蛋白的表达。结果:木香挥发油对MV4-11细胞的半抑制浓度(IC50)为13.33 mg·L~(-1);木香挥发油作用于MV4-11细胞24 h后可使细胞核皱缩,染色质凝聚,形成明显的凋亡小体;与空白组比较,木香挥发油G0/G1期和G2/M期细胞明显减少,S期细胞明显增多(P0.05,P0.01);与空白组比较,12,25,50,100,150 mg·L~(-1)木香挥发油能诱导MV4-11细胞凋亡(P0.05);与空白组比较,25,50,100,150 mg·L~(-1)木香挥发油可抑制AKT的磷酸化,并促进Caspase-3蛋白的降解(P0.05,P0.01)。结论:木香挥发油能抑制人白血病细胞MV4-11细胞的增殖,其作用机制可能与抑制AKT活性进而诱导细胞凋亡效应有关。     

广藿香醇通过PKM2和NF-κB诱导MV4-11细胞凋亡相关机制

目的:探讨广藿香醇(PA)诱导MV4-11细胞凋亡,并探讨其可能存在的相关活性。方法:采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测PA对人结、直肠癌细胞HCT116,人肝癌细胞Hep G-2,人肺癌细胞A549,人急性淋巴髓单核细胞白血病细胞MV4-11,人皮肤黑色素瘤细胞A375,小鼠乳腺癌细胞4T1,人单核细胞型淋巴瘤细胞THP-1,人正常胚肾293A细胞的增殖抑制作用;采用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡的形态学变化;通过Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法并应用流式细胞术检测细胞凋亡;免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化M2型丙酮酸激酶(p-PKM2),核转录因子-κB(NF-κB),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)凋亡蛋白的表达。结果:PA能抑制人HCT116,Hep G-2,A549,MV4-11,A375,4T1,THP-1,293A细胞的增殖,半抑制浓度(IC50)分别为0.26,0.32,0.28,0.09,0.37,0.23,0.24,0.33 mmol·L-1;作用于MV4-11细胞24 h后可使细胞核皱缩,染色质凝聚,形成明显的凋亡小体。0.1,0.2,0.5 mmol·L-1PA能诱导MV4-11细胞凋亡,凋亡率分别为7.9%,13.6%,22.0%,与溶剂组比较,结果具有统计学差异(P0.05);Western blot检测显示,PA使细胞NF-κB,p-PKM2,Caspase-3蛋白表达发生明显改变(P0.05)。结论:PA能抑制人白血病细胞MV4-11细胞的增殖,并诱导其发生凋亡,作用机制可能与NF-κB,p-PKM2,Caspase-3蛋白量的改变有关。