可视化血红素加氧酶-1小鼠模型用于药物肝毒性评价

目的 建立实时动态监测药物肝毒性小鼠模型,用于药物肝毒性临床前评价.方法 通过水动力高压转染法将表达萤火虫荧光素酶的血红素加氧酶-1(HO-1)报告基因质粒转染到小鼠肝细胞中,建立HO-1-Luc小鼠模型.使用HO-1-Luc小鼠模型动态监测对乙酰氨基酚(APAP)导致的肝损伤以及抗氧化剂谷胱甘肽对药物性肝损伤的治疗效果.结果 使用HO-1-Luc小鼠模型通过活体荧光成像的手段能监测到APAP引起的肝毒性,与通过活性氧相关标志物、转氨酶以及组织病理学等经典肝毒性检测手段得到的结果吻合.同时该小鼠模型能够监测到谷胱甘肽对APAP诱导的肝毒性保护作用.结论 建立的HO-1-Luc小鼠模型在药物临床前肝毒性评价中具有潜在应用价值.     

腺病毒转染法构建表达乙型肝炎病毒核心蛋白小鼠肝癌细胞系及其在乙肝疫苗评价中的应用

目的 构建一种可高效表达乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)核心蛋白(HBc)C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系,并以其作为靶细胞评价乙肝基因疫苗在C57BL/6小鼠体内所引起的HBc特异性细胞毒性T细胞(CTL)的活性.方法 以HBV全基因组为模板,采用PCR方法扩增HBc基因,插入AdEasy腺病毒穿梭载体,构建携带HBc蛋白的腺病毒穿梭载体AD-HBc,电转携带有腺病毒骨架质粒(Ad-Easy)的E.coli BJ5183感受态细胞,获得重组腺病毒质粒AD-CMV-HBc,经PmeⅠ线性化处理后转染HEK293细胞进行包装得到相关的重组腺病毒,再感染C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系Hepa1-6.结果 成功构建表达HBc蛋白的重组腺病毒,在体外对Hepa1-6细胞的感染率几乎为100％,并且HBc蛋白得到高效表达.以此为靶细胞用于pVAX1-HBc基因疫苗免疫C57BL/6小鼠产生的CTL活性的体外检测.结论 我们成功构建HBc蛋白表达的靶细胞系,对研究乙肝病毒核心抗原(HBcAg)所引起的细胞免疫反应及乙肝发病机理等方面有重要意义.     

生物素化标签真核表达载体的构建及其在蛋白检测中的应用

目的构建生物素化标签真核表达载体,利用生物素化蛋白检测快速、灵敏、简便的特点,对传统的Western印迹和pull down技术进行改进和优化。方法利用pCI neo载体骨架构建生物素化真核表达载体。将红色荧光蛋白插入表达载体,用辣根过氧化物酶标记的链亲和素对融合蛋白进行Western印迹检测;将萤火虫荧光素酶插入表达载体,利用pull down技术定量分析生物素化效率;将丙型肝炎病毒NS4B蛋白插入表达载体,通过pulldown技术研究丙型肝炎病毒NS4B蛋白的蛋白质间相互作用。结果构建的生物素标签真核表达载体能使目的蛋白生物素化。报告基因定量分析结果表明目的蛋白生物素化效率达72%。将该载体表达的融合蛋白应用于Western印迹和pull down技术中可实现无需特异性抗体的一步法快速检测。结论将生物素化标签真核表达载体用于Western印迹和pull down技术,建立了快速、灵敏、简便的融合蛋白质检测新方法,为生命科学领域提供了一种有利的研究工具和通用技术平台。     

脂联素对刀豆球蛋白A诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用

目的探讨脂联素(ADPN)是否对肝脏的免疫性损伤具有保护作用以及可能的作用机制。方法将小鼠ADPN基因高效表达载体导入小鼠体内,获得高血清ADPN模型小鼠(表达载体组),与导入空载体的对照小鼠(空载体组)同时静脉内注射刀豆球蛋白A(Con A),以诱导肝脏的免疫性损伤,测定不同时间点血清ALT浓度,并进行肝组织病理学检查(HE染色),观察两组小鼠肝脏损伤程度是否有差异。比较两组间血清TNFα浓度的不同,探讨可能的作用机制。结果表达载体组小鼠注射Con A后血清ALT水平的升高明显低于空载体组,差异有统计学意义(P<0.01),组织学检查也显示表达载体组小鼠的肝损伤明显低于空载体组。经统计分析表明,ALT水平与血清ADPN水平成负相关(r=-0.5034,P=0.0121)。表达组小鼠血清TNFα水平明显低于空载体组(P<0.01)。结论脂联素对Con A诱导的肝脏免疫性损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制TNFα的产生进而阻断肝细胞遭受免疫性攻击有关。     

SEN病毒D亚型中国株流行病学及序列变异

目的 了解SEN病毒D亚型中国株的流行病学特点及其进化地位。方法 分析已知的基因序列设计引物，建立半套式PCR检测方法，对58份献血者血清样本和25份non-A-E肝炎患者血清样本进行了SENV-D亚型的检测，并对部分阳性血清的PCR产物进行克隆测序。结果 无偿献血者中SENV-D亚型感染率为45％，在non-A-E肝炎患者中SENV-D亚型感染率为48％，两者间差异无显著性；但在无偿献血者中SENV-D亚型的阳性检出率大大高于国外报道。测序结果经BLASTP软件在GenBank中检索表明，各测序株均与已知的SENV-D株序列有很高的同源性，并在此基础上用MegAlign软件进行进化树分析。结论 建立的半套式PCR检测方法适用于SEN病毒D亚型检测；SENV-D亚型中国株之间以及与已发表的国外SENV-D株序列之间有变异。与无偿献血者相比，non-A-E肝炎患者血清SENV-D株无进化上的显著倾向性。在测序的部分ORFl序列中存在一个核苷酸高变区。     

切刻内切酶介导恒温扩增技术条件优化

目的 采用切刻内切酶介导恒温扩增技术(nicking enzyme mediated isothermal amplification,NEMA)扩增蜡样芽孢杆菌质粒,考察缓冲体系、温度、离子浓度等条件对扩增效率的影响.方法 通过独特的引物设计,采用NEMA技术扩增蜡样芽孢杆菌质粒,通过系列实验优化了缓冲体系、温度和离子浓度等条件,采用琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.结果 通过设计不同长度片段的扩增产物,证明采用NEMA技术进行恒温扩增引物设计的正确性.扩增反应中,缓冲体系的组成、扩增温度、体系镁离子及二甲基亚砜(DMSO)的浓度会影响切刻内切酶恒温扩增效率,而海藻糖添加与否在本实验中与扩增效率无关.在最优条件下,NEMA恒温扩增方法对于蜡样芽孢杆菌质粒的灵敏度达到1.7 pmol/L.结论 NEMA可以用来进行较长片段的扩增,有望成为一种常规的恒温扩增技术,应用到战时或者应急条件下的快速核酸诊断中.     

水动力转染技术及其在肝炎病毒实验动物模型研究中的应用

水动力转染方法是指从小鼠尾静脉快速注射大体积含目的基因的生理盐水,从而实现外源基因在小鼠体内(尤其是肝脏内)的高效表达.它作为一种快速、简单、高效、安全的外源基因转染方法,已经广泛用于体内基因功能、基因调节、蛋白表达和基因治疗等方面的研究.由于该方法转染的目的基因主要在小鼠体内肝脏获得高水平表达,特别适用于肝炎病毒功能基因小鼠体内表达模型的建立.利用该技术建立的肝炎病毒实验动物模型有助于促进肝炎病毒致病机制的研究以及抗病毒药物的体内筛选与评价.     

聚合酶链反应检测SEN病毒D和H亚型方法的建立及比较

SEN病毒(SENV)是新近发现怀疑与输血相关的non-A-E型肝炎有关的一种病毒.我们实验室首次证实在我国也存在SENV感染[1],为进一步了解其致病性,我们在前期工作的基础上,参考已发表的文献[2]及基因序列,建立了两种特异性检测SENV-D和SENV-H的套式PCR方法.     

不同表面化学修饰金纳米棒的血液相容性

目的 采用化学修饰获得不同表面功能基团、不同电性质金纳米棒(GNR),考察其血液相容性差异.方法 采用“种子调制生长法”制备GNR,对其表面进行化学修饰得到电中性的聚乙二醇(PEG)修饰GNR(PEG-GNR)、带负电的巯基十一烷酸(MUA)修饰GNR(MUA-GNR)及带正电溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)修饰GNR(CTAB-GNR).采用透射电镜、表面等离子共振及zeta电位测量对修饰前后的GNR进行表征.通过溶血实验及血浆复钙实验评价3种不同电性质、不同化学修饰GNR的血液相容性.结果 3种不同化学修饰GNR对血液中红细胞的破坏程度依次为:PEG-GNR＜ CTAB-GNR＜ MUA-GNR.PEG-GNR在较高剂量1.7 g/L时,溶血率已小于5％.血浆复钙实验结果表明,相同剂量的3种修饰中,CTAB-GNR的复钙时间动力学曲线明显由陡峭趋于平缓,且复钙时间延长最多(33 min),其次为PEG-GNR(21 min).结合产生丝状不溶物的量可知,PEG修饰的GNR具有最佳的抗凝血性能.结论 综合溶血实验及血浆复钙实验结果可认为,表面PEG化能显著改善GNR材料的血液相容性.