丙型肝炎治疗药物研究进展

摘 要丙肝病毒（HCV）感染是一个全球公共卫生热点问题,感染丙肝后慢性化概率极高,容易并发肝硬化等并发症,严重危害身体健康。近年,随着直接抗病毒治疗药物（DAAs）的诞生和发展,为慢性丙型肝炎(CHC)治疗带来了福音,当前泛基因型直接抗病毒药物是当前丙肝治疗的发展趋势。目前国际上已上市的DAAs主要有特拉瑞韦(telaprevir)、波塞瑞韦(boceprevir)、达卡他韦（daclatasvir）、索磷布韦 （sofosbuvir）、西米匹韦（simeprevir）;含2种及以上靶点抑制药组成的固定复方制剂主要有哈维尼（harvoni）、伊柯鲁沙（epclusa）等。本文主要综述近年来DAAs的研发进展,以期为CHC防治提供依据。     

湖北省2014—2023年登革病毒包膜蛋白基因特征分析

目的 分析2014—2023年湖北省登革热感染病例包膜蛋白（envelope,E）基因特征并进行生物学溯源方法 收集疑似登革热病例血清标本,对标本进行核酸检测及血清分型,核酸阳性标本采用RT-PCR扩增E基因并进行测序分型,获得基因序列用MEGA 11.0软件进行基因特征分析。结果 2014—2023年湖北省共检测登革热核酸阳性病例78份,成功获得44份标本的登革病毒（dengue virus, DENV）E基因序列,其中血清Ⅰ型(DENV-Ⅰ)39份,血清Ⅱ型(DENV-Ⅱ)5份;进化分析显示,DENV-Ⅰ中37例为基因Ⅰ型(GⅠ),分布在三个不同分支上,主要与中国广州、新加坡、印度尼西亚、泰国和缅甸等东南亚国家流行株进化距离较近,2例为基因Ⅴ型(GⅤ)与中国广州和印度流行株进化距离较近;DENV-Ⅱ中5例均为混合型(cosmopolitan型)与输入地流行株进化距离较近。结论 2014—2023年湖北省存在多型登革病毒感染,主要流行株为DENV-Ⅰ的GⅠ亚型,与中国广州和东南亚国家亲缘关系较近,提示湖北省应加强登革热跨省、跨境传播的防控,同时谨防登革重症及死亡病例的出现。     

湖北省2016-2021年麻疹病毒流行株基因型特征

目的 分析湖北省麻疹病毒流行株基因型特征。方法 收集湖北省2016-2021年麻疹监测病例咽拭子标本，进行麻疹病毒核酸检测、分离培养、N基因C末端基因扩增，构建分离株与基因库(GenBank)中麻疹病毒基因型参考株的系统进化树，分析核苷酸同源性和基因型别。结果 从湖北省2016-2021年麻疹监测病例中共获得335株麻疹病毒流行株，其中H1基因型327株(2016-2018年)、B3基因型5株(2019年)、疫苗株A基因型3株(2016年和2021年)。H1基因型麻疹病毒分离株之间的核苷酸同源性为98.40%-98.90%,与H1基因型参考株的核苷酸同源性为97.30%-97.80%;B3基因型麻疹病毒分离株之间的核苷酸同源性为99.30%-100%,与B3基因型参考株的核苷酸同源性为97.10%-97.60%。结论 2016-2018年湖北省麻疹病毒优势流行株仍为中国本土H1基因型，2019年首次发现B3基因型，2021年仅检测到疫苗株A基因型。需继续加强麻疹病毒基因型监测，及时发现和阻断输入性麻疹传播。     

湖北省荆门市2022年蚊虫流行性乙型脑炎病毒携带调查

目的 了解湖北省荆门市蚊虫流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)携带状况。方法 2022年7-8月在荆门市3个镇/街道选取7个点采集蚊虫标本，采用形态学方法鉴定蚊虫种类，采用实时荧光定量聚合酶链反应检测JEV核酸，计算蚊种的批阳性率和最低现场感染率，采用逆转录聚合酶链反应对JEV的E基因进行扩增和序列分析。结果 共采集4 920只蚊虫标本，其中致倦库蚊、白蚊伊蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊分别占56.10%、41.46%、1.83%、0.61%;仅2批次致倦库蚊的JEV核酸检测阳性，批阳性率、最低现场感染率分别为6.67%(2/30)、0.07%(2/2 760)。2株JEV分离株均为基因Ⅰ型，与中国浙江省和陕西省分离株亲缘关系最近。结论 调查地区2022年蚊虫标本JEV携带率较低，蚊虫中存在基因Ⅰ型JEV循环。需持续开展蚊种JEV监测，警惕乙脑流行风险。     

肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b( ).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b( )-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.     

幽门螺旋杆菌ureB、vacA基因的原核表达产物及其与感染病人血清的免疫反应性

目的 在大肠杆菌中重组表达幽门螺旋杆菌UreB、VacA蛋白,并对目的产物与感染病人血清的反应性进行验证.方法 PCR扩增获得ureB、vacA基因,分子生物学方法将基因片段克隆人pET22b( )表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,表达产物经Ni离子亲和层析进行纯化,纯化产物采用Western Blot方法鉴定其与感染病人血清的免疫反应性.结果 构建的重组大肠杆菌高效表达UreB、VacA蛋白,Ni离子亲和层析后获得90%以上纯度的目的蛋白,与感染病人血清具有良好的免疫反应性.结论 重组UreB、VacA蛋白可作为幽门螺旋杆菌感染检测的候选分子.     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌影生物学活性的初步研究

目的制备肠出血性大肠埃希菌O157∶H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价。方法将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影。利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附。将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果。结果成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157∶H7及DH5α菌影。O157∶H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞。O157∶H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生。攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157∶H7 EDL933强毒株的保护率达到80%。结论 O157∶H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157∶H7菌影疫苗奠定了基础。     

新型重组人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体的制备及活性分析

目的：利用大肠杆菌表达新型人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体ScFv,并验证其活性。方法：采用基因融合获得ScFv基因,构建重组表达质粒pET-22b（＋）-ScFv,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达。结果：Western印迹显示目的蛋白表达正确,表达产物以包涵体形式存在,经Ni-NTA柱纯化和体外复性,获得纯度达90%的ScFv蛋白。ELISA结果显示在PBS及人血清中ScFv的结合稳定性有所提高,流式细胞术证明目的蛋白能靶向结合狂犬病毒,通过中和效价测定实验测得ScFv的中和效价为40 U/mg。结论：成功利用原核表达系统实现了对人源抗GPRV ScFv的表达,并且具有一定的中和活性。     

谵妄运动亚型的临床研究

目的 探讨各谵妄运动亚型之间病情危重程度和谵妄症状严重程度的差异性.方法 选择2015年12月至2017年4月在我院重症医学科住院且资料齐全的307例谵妄患者,使用谵妄运动亚型分型量表(Delirium motor subtype scale,DMSS)进行运动亚型分组,分为4组:活动增多型(Hyperactive),活动减少型(Hypoactive),混合型(Mixed),其他型(No subtype),分别采用急性生理与慢性健康评分(Acute physiology,age and chronic health evaluation,APACHE Ⅱ)对病人病情危重程度进行评估,使用谵妄认知功能测查量表(Cognitive test for delirium,CTD)对谵妄患者的认知功能测量打分,使用谵妄评定量表98修订版(Delirium rating scale,DRS-98)对谵妄症状严重程度进行评估.同时回顾性整理各谵妄运动亚型患者的年龄、性别等临床资料,进行统计学分析.结果 对谵妄运动亚型间做多重比较,APACHE II均值和标准差分别是,活动减少型(21.87士6.63),其他型(18.99士7.26),提示活动减少型和其他型组间存在差异(P=0.013);各谵妄运动亚型的CTD评分组间存在差异(F=8.89,P=0.000),各谵妄运动亚型的DRS-98评分组间存在差异(F=72.94,P=0.000).对年龄进行组间比较无差异性(F=0.693,P=0.557),而各组间性别无差异性(Pearsonx2=2.083,P=0.260).结论 活动减少型的病人病情危重程度重于其他型,各谵妄运动亚型之间症状严重程度不同.     

大肠杆菌细菌菌蜕的制备及初步研究

目的:利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备大肠杆菌细菌菌蜕,鉴定其裂解效率并观察其形态.方法:利用PCR技术扩增分离了噬菌体PhiX174裂解基因E并构建其表达质粒,并将质粒转化大肠杆菌DH5α构建工程菌.工程菌培养温度从28℃突升至42℃,每15 min检测菌液D600值,诱导后4 h收集菌体.体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌蜕结构.结果:获得273 bp的PhiX174裂解基因E全长基因及表达质粒.菌液D600在温度突升至42℃后30 min开始持续下降,2 h后基本维持不变.4 h后收集菌体测得裂解效率为99.99%.电镜观察菌蜕为具有完整外膜结构的细菌空壳,并且无细胞毒性.结论:本研究成功利用噬菌体PhiX174裂解基因E实现了大肠杆菌细菌菌蜕的制备,为进一步的疫苗及递送系统研究奠定了基础.