GBX2过表达促进人宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移及侵袭

[摘要] 目的：探讨GBX2 基因在人宫颈癌SiHa 细胞增殖和侵袭转移中的作用及其机制。方法：应用质粒转染技术,分别将过表达GBX2 基因重组质粒pCMV6-entry-GBX2（实验组）及空载体质粒pCMV6-entry（阴性对照组）转染到宫颈癌SiHa 细胞中,用WST-1 法、集落形成实验、流式细胞术分别检测转染细胞的增殖、集落形成和细胞周期,用划痕愈合实验、Transwell 实验检测细胞的迁移、侵袭能力,用ELISA 法检测细胞培养上清中IL-6 的表达水平,用WB检测EMT相关蛋白的表达变化并探讨其可能的作用机制。结果：与SiHa/pCMV6 组相比,上调GBX2 表达后：（1）SiHa/GBX2 组细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显增强（均P<0.01）,G0/G1 期的细胞比例减少、S期与G2/M期的细胞比例增加（均P<0.01）;（2）SiHa/GBX2 组细胞EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白表达水平下降,神经钙黏蛋白、波形蛋白和snail 表达水平上调（均P<0.01）;（3）SiHa/GBX2 组细胞培养上清中IL-6 的表达水平明显增高（P<0.01）;（4）SiHa/GBX2 组细胞STAT3 磷酸化水平增强,并能被STAT3 抑制剂S31-201 抑制（P<0.01）。结论：GBX2可能通过IL-6/STAT3 通路诱导宫颈癌SiHa 细胞EMT,从而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

小分子乙型肝炎病毒基因组缺失突变体结构分析

目的 了解小分子HBV基因组缺失突变体的基因结构及特点.方法 采用一步法PCR从慢性乙型肝炎患者血清中扩增全基因组HBV DNA,回收并克隆＜1 kh的小分子HBV DNA,测序并以BioEdit及VectorNTI 6.0软件分析基因结构特点.结果 获得基因长度介于174～986 bp之间的64种、共124个小分子HBV缺失突变体DNA,按基因结构特点分为3类,即3种GT-AG剪接变异体、29种"常规"缺失突变体及32种基因组内部含polyA的缺失突变体.所有小分子基因组缺失突变体在HBV各编码区及基因调控区均存在不同程度缺失,其中66%(42/64种)保留与HBV复制(包装)相关的所有顺式调控序列,48%(31/64种)保留X编码区.结论 乙型肝炎患者血清中普遍存在小分子HBV基因组缺失突变体,深入了解这些变异体的结构和功能,有助于进一步探索HBV的致病机制.     

通福袋泡茶对小鼠润肠通便作用的实验研究

目的　研究通福袋泡茶对实验小鼠的润肠通便作用。　方法　以三个剂量组 :0 .17g/ kg· bw;0 .3 3 g/ kg·bw;0 .66g/ kg·bw,经口给予小鼠连续灌胃 10 d后分别进行小鼠小肠推进试验、小鼠湿粪计数试验。　结果　与模型对照组比较 ,0 .66g/ kg·bw剂量组能促进小鼠小肠推进作用 ( P<0 .0 5 ) ;各剂量组均能使小鼠首次排便时间显著缩短 ( P<0 .0 5 ) ,0 .66g/ kg·bw剂量组明显增加粪便粒数、粪便重量 ,提高排便频率 ( P<0 .0 5 )。　结论　通福袋泡茶具有润肠通便的功效。     

一种新型的乙型肝炎病毒剪接变异体

目的 证实乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)前基因组RNA在458nt～1308nt(nt，核苷酸)之间可发生剪接并产生相应的基因组剪接变异体。方法对1株分离自慢性乙型肝炎患者血清的亚基因组HBVDNA(2366bp)进行测序并以Vector NT16．0软件进行分析。将全基因组HBVDNA(3215bp)理论上可能的剪接供体及受体内的核苷酸进行定点突变并将突变株转染HepG2细胞，以位于HBVDNA458nt及1308nt两侧的特异引物检测转染后的细胞内HBV核心颗粒DNA，并以相同引物检测458nt～1308nt发生缺失的HBV DNA在不同病程的乙型肝炎患者血清中的存在情况。结果23661bp HBV DNA在458nt～1308nt之间发生缺失并符合GT-AG剪接模式。3215bp全基因组HBV DNA在459nt及1306nt分别发生G→A及A→C突变后均不能产生458nt～1308nt缺失。458nt～1308nt发生缺失的HBVDNA在慢性乙型肝炎、肝硬化及原发性肝细胞癌患者血清的检出率分别为80％、75％及70％，显著高于HBV无症状携带者10％的检出率。结论HBV前基因组RNA在458m～1308nt之间可发生剪接并产生长度为2366bp的基因组剪接变异体。该类型基因组剪接变异体基因结构特点及在HBV相关性肝病中广泛存在提示它与HBV致病性密切相关。     

23株HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者病毒的全基因组分析

目的研究HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者HBV变异特点。方法PCR扩增并克隆HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中HBV全基因组DNA,测序并进行基因结构分析。结果获得23株HBV全基因组DNA,它们均属于c或B基因型。与中国HBVB、C基因型参照序列相比,HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者来源的HBV在表面抗原、P蛋白、X蛋白的反式激活区及增强子II／核心启动子区发生了一些有意义的共有变异。结论HBV变异可能与HBeAg阳性慢性乙型肝炎的发生、发展有关。     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

MG132对乳腺癌细胞株MICA蛋白稳定性及NK杀伤活性作用

目的探讨蛋白酶体抑制剂MG132对乳腺癌细胞株MHC-I类相关分子A(MHC class I-related molecules A,MICA)蛋白稳定性及NK杀伤活性作用。方法乳腺癌细胞株MICA全基因检测。构建乳腺癌细胞株MICA等位基因真核表达载体,转染293T细胞。流式细胞术及Western blot检测乳腺癌细胞株MICA表达。MTT检测MG132对乳腺癌细胞生长抑制。LDH检测NK细胞杀伤活性。结果 MDA-MB-231基因序列为MICA*019/A5,MDA-MB-435S基因序列为MICA*010/A5,仅在蛋白N端(膜外区)第29位氨基酸有差异:MICA*019/A5在该位点为Arg(精氨酸),而MICA*010/A5在该位点为Pro(脯氨酸),Arg或Pro位点在蛋白结构的一个beta折叠上,而且是处于偏中间的位置。MG132对转染的293T细胞增殖均有明显抑制作用。MG132处理转染的293T细胞后,MDA-MB-435S MICA基因来源的293T细胞MICA表达降低,并随作用时间影响更明显,对NK杀伤敏感下降。MDA-MB-231 MICA基因来源的293T细胞MICA表达无明显改变,对NK杀伤活性敏感性不受影响。结论 NK杀伤敏感性与乳腺癌细胞MICA表达密切相关,MG132影响MDA-MB-435S MICA稳定性,所以影响NK杀伤敏感性,MDA-MB-231不受影响。     

表观遗传修饰介导抑制SOSTDC1表达促进宫颈癌细胞的恶性生物学行为

目的：探究含硬化蛋白域蛋白1（SOSTDC1）对宫颈癌细胞恶性生物学行为的调控及其分子机制。方法：收集2020年8 月至2022 年5 月间在福建省肿瘤医院活检或手术切除的53 例宫颈癌组织和相应的癌旁组织标本,免疫组化法检测SOSTDC1 蛋白在宫颈癌组织及相应癌旁组织中的表达,qPCR 法检测正常宫颈细胞、宫颈癌细胞中SOSTDC1 mRNA 表达;将SOSTDC1 过表达慢病毒（OE-sostdc1）和对照空病毒（NC）感染宫颈癌细胞SiHa 及CaSki,将其分为SiHa-OE-sostdc1、SiHa-NC、CaSki-OE-sostdc1、CaSki-NC 组,采用WST-1法、细胞集落形成实验、Transwell 实验和WB法检测转染各组SiHa 及CaSki 细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力和BMP、Wnt/β-catenin 信号途径相关蛋白及上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白的表达。用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂2''-脱氧胞苷（5''-Aza-CdR）处理宫颈癌细胞后采用qPCR和WB法检测SOSTDC1 mRNA及蛋白的表达变化,用甲基化特异性PCR（MSP）检测5 例配对宫颈癌组织与癌旁组织中SOSTDC1 基因启动子区甲基化水平,同时qPCR 检测其SOSTDC1 mRNA水平。结果：与癌旁组织比较,SOSTDC1蛋白在宫颈癌组织中呈低表达（P<0.01）,且与淋巴结转移与FIGO分期有关联（均P<0.05）;与正常宫颈HUCEC细胞比较,SOSTDC1 mRNA 在宫颈癌C33A、HeLa、SiHa、CaSki 细胞中均呈低表达（均P<0.01）。过表达SOSTDC1显著抑制SiHa 及CaSki 细胞的增殖、迁移和侵袭能力（均P<0.05）。WB法结果检测显示,过表达SOSTDC1 显著抑制 SiHa 及 CaSki 细胞中磷酸化 Smad、Dvl2/3、β -catenin、VIM、N-cadherin、Snail 蛋白的表达（均P<0.05）,5''-Aza-CdR 处理后的SiHa 及CaSki 细胞中SOSTDC1 mRNA和蛋白水平均显著增加（均P<0.05）,MSP检测结果显示,相较于癌旁组织,宫颈癌组织中SOSTDC1基因启动子区呈高度甲基化,且SOSTDC1 mRNA水平降低（P<0.01）。结论：SOSTDC1在宫颈癌组织中呈低表达且与肿瘤的恶性进展关联,其表达下调与其基因启动子区高度甲基化有关,过表达SOSTDC1 可能通过阻断BMP及Wnt/β-catenin信号通路从而抑制SiHa、CaSki细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较

目的 研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别.方法 PCR扩增B、C基因型HBV X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC-XB及pcDNA3.1/HisC-XC).以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2细胞,采用融合表达的X-press多肽表位抗体,通过Western blot检测目的 蛋白在不同时间段的表达.PCR扩增MDR1基因启动子并克隆于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3-Basic(重组载体为pGL-MDR).pGL-MDR分别与pcDNA3.1/His-GXB或pcDNA3.1/HisC-XC共转染HepG2细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性.实验数据以SPSS 11.5软件分析.结果 成功克隆X蛋白表达载体及MDR1报告载体.Western blot显示pcDNA3.1/HisC-XB或pcDNA3.1/HisC-XC在HepG2细胞中均能表达HBV X蛋白,以转染后48 h为最高.当pGL-MDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2～1∶4范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为pcDNA3.1/HisC-XB pGL-MDR组＞pcDNA3.1/HisC-XC pGL-MDR组＞pcDNA3.1/HisC pGL-MDR组(对照组),且存在剂量-效应关系.结论 B、C基因型HBV X蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,且B基因型强于C基因型.     

乙型肝炎病毒X蛋白通过DNMT3A诱导肝癌细胞RUNX3基因高甲基化

目的研究肝癌细胞中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对抑癌基因Runt相关转录因子3(RUNX3)表达的影响及相关作用机制,探讨乙肝病毒促肝癌发生的表观遗传调控。方法HBx重组表达载体转染5-aza-CdR处理或未处理的Huh7、HepG2肝癌细胞,Western Blot及RT-qPCR检测RUNX3 的表达,分析RUNX3基因启动子CpG岛甲基化水平。合成DNA甲基转移酶3A的小干扰RNA(siRNA_3A)单独转染或与HBx共转染,检测RUNX3的表达。PCR检测21例手术切除的肝细胞癌新鲜组织标本HBx表达情况,比较HBx阴性与HBx阳性组织样本间RUNX3的表达差异以及启动子甲基化程度。结果过表达HBx可导致肝癌细胞内RUNX3表达下调,且甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR可完全阻断HBx对RUNX3的抑制作用。HBx诱导RUNX3基因启动子CpG岛发生高甲基化,但不影响DNA甲基转移酶的表达。siRNA_3A转染肝癌细胞后,RUNX3 mRNA与蛋白表达均显著上调;其与HBx共转染后,逆转了单独HBx对RUNX3的抑制作用。HBx阳性的肝癌组织中RUNX3 mRNA表达水平较HBx阴性组低,且RUNX3启动子甲基化程度也相对较高。结论HBx通过促进RUNX3启动子区域发生高甲基化而抑制其表达,且这一过程是由DNMT3A所介导的。