基于常见遗传变异和传统风险因素的中国南方汉族人群结直肠癌风险预测模型研究

目的 基于结直肠癌全基因组关联研究(GWAS)发现的易感位点,联合传统风险因素建立中国南方汉族人群结直肠癌风险预测模型。方法 对1 066例结直肠癌患者和3 880例健康对照的21个GWAS候选位点进行基因分型,分析其与结直肠癌易感性之间的关联。通过遗传风险评分(GRS)和加权遗传风险评分(wGRS)计算显著候选位点的联合效应。以不同方式组合遗传风险评分和传统风险因素,构建结直肠癌风险预测模型,并绘制受试者工作特征曲线评价模型优劣性。结果 7个候选位点与结直肠癌易感性显著相关。随着风险评分的升高,人群患结直肠癌的风险也随之升高(GRS:P=0.002 6,wGRS:P<0.000 1),相比于四分位分组中最低一组,GRS和wGRS最高的一组OR值分别为1.33(95%CI:1.12~1.58,P=0.001 0)和1.76(95%CI:1.45~2.14,P<0.000 1)。联合传统风险因素和wGRS的模型为最优模型,其曲线下面积为0.593(95%CI:0.573~0.613)。结论 结直肠癌易感位点间存在显著的联合作用。相比于传统风险因素模型,传统风险因素结合加权遗传风险评分模型能更好预测结直肠癌的患病风险。     

甲壳素纤维织品体外抗细菌和癣菌活性的研究

目的　观察甲壳素含量不同的针织布体外抑制或杀灭细菌或癣菌的作用。方法　采用不同细菌或癣菌接种量 (1× 10 6～ 1× 10 2 /mL) ,用体外抑菌试验和杀菌试验检测 10 0 %甲壳素纤维无纺布、2 0 %甲壳素针织布和 10 %甲壳素针织布对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、红色毛癣菌、紫色毛癣菌和石膏状毛癣菌的抗菌作用 ,实验中以普通全棉布作为对照。结果　作为对照的普通全棉布对上述细菌或癣菌无任何抑制作用。与普通全棉布比较 ,10 0 %甲壳素纤维无纺布、2 0 %甲壳素针织布和 10 %甲壳素针织布对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、红色毛癣菌、紫色毛癣菌和石膏状毛癣菌的抑制率 [抑制率 =(每毫升CFU值 每毫升接种量 ) /每毫升CFU值× % ]分别高于普通全棉布的 99.8%～ 99.9%、85 .2 %～ 89.6%和 74.2 %～ 85 .8% ,表明随甲壳素纤维含量逐渐增高 ,抑菌作用逐渐增强 (χ2 ≥ 18.2 5 ,P <0 .0 1)。所有甲壳素纤维织品均未发现有体外杀菌活性。结论　受试的甲壳素纤维织品无体外杀菌活性 ,但均有一定的体外抑制细菌或癣菌作用 ,以 10 0 %甲壳素纤维无纺布抑制作用最强 ,2 0 %甲壳素针织布次之 ,10 %甲壳素针织布较弱。     

肺炎链球菌ciaH/R基因重组表达及CiaH/R与β-内酰胺类耐药相关性

目的：构建肺炎链球菌ciaH和ciaR基因的原核表达系统，探讨ciaH和CiaR封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长ciaH和ciaR基因，以常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS—PAGE及Bio—Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaH和rCiaR表达量。制备rCiaH和rCiaR兔抗血清及其IgG。检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后，细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化。结果：与报道序列比较，所克隆的ciaH和ciaR基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．9％～100％和100%。所构建的工程菌E．coli BL21DE3^pET42A-ciaH和E．coli BL21DE3^pET42a-ciaR能高效表达目的重组蛋白rCiaH和rCiaR，其产量分别高达细菌总蛋白的33％和45％。rCiaH、rCiaR抗血清及其IgG免疫双扩散效价分别为1：4、1：4和1：1、1：1。CiaH—IgG胞外或胞内封闭CiaH、CiaR—IgG胞内封闭CiaR后，青霉素及头孢噻肟敏感菌株可出现对两种抗生素的耐药性，但对耐药菌株耐药性无明显影响。结论：成功地构建了肺炎链球菌ciaH／ciaR基因原核表达系统，为深入研究该TCS与耐药性关系奠定了基础。CiaH和CiaR均与肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟耐药性有关。     

大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定

目的：克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）及霍乱弧菌肠毒素B亚单位（CTB）基因，构建其表达载体。方法：采用高保真PCR分别从E.coli44815株与V.cholerae东74株基因组DNA中扩增LTB与CTB基因，T-A克隆后测定核苷酸序列。分别构建pET32a的LTB及CTB表达载体，在E.coliBL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE及GM1-ELISA鉴定表达产物。结果：所克隆的LTB和CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为99.12％-99.71％和98.54％-99.42％，氨基酸序列同源性分别高达97.58％-99.19％和96.77％-99.19％。pET32a-LTB-BL21DE3和pET32a-CTB-BL21DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的30％和10％左右。GM1-ELISA结果证实LTB及CTB融合蛋白均能与牛GM1结合。结论：本研究成功地构建了LTB与CTB表达系统，所表达的LTB与CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。     

铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响

目的 分析氨基糖苷类抗生素敏感或耐药铜绿假单胞菌菌株二元信号系统PhoQ/PhoP编码基因序列并确定该系统与耐约性关系.方法 采用PCR获得铜绿假单胞菌菌株全长phoQ和phoP基因片段,T-A克隆后测序.构建phoQ和phoP基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的 重组表达产物rPhoQ和rPhoP,皮内注射免疫法制备兔抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价.采用Red重组系统敲除氨基糖苷类抗生素耐药铜绿假单胞菌菌株phoQ基因,采用PCR、测序和Western blot对phoQ突变株进行鉴定.采用试管稀释法测定各铜绿假单胞菌野生株和突变株对4种氨基糖苷类抗生素的最低抑菌浓度(MIC).结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的phoP和phoQ基因核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%～99.6%和98.7～100%、98.4%～99.8%和99.1%～100%.采用pET-42a和E. coli BL21DE3系统成功地表达了rPhoQ和rPhoP.rPhoQ和rPhoP兔抗血清免疫双扩效价分别为1:4和1:8抗血清.经PCR、测序和Western blot鉴定,两株phoQ突变株phoQ基因及产物均缺失.上述phoQ突变株对4种氨基糖苷类抗生素的MIC值分别为其野生株的1/512～1/2048.结论 PhoQ/PhoP是序列保守的铜绿假单胞菌二元信号转导系统,该系统介导细菌对氨基精苷类抗生素的耐药性.     

16S rDNA多重PCR检测牙周组织感染菌及混合感染与慢性牙周炎病变程度关系的研究

目的　建立多重 16SrDNAPCR检测慢性牙周炎 (CP)标本中牙龈卟啉单胞菌 (Pg)、伴放线杆菌 (Aa)和齿垢密螺旋体 (Td) ,了解不同感染情况与CP严重程度的关系。方法　将轻、中和重度15 2例CP患者牙周袋标本和 30名牙周健康者龈沟标本置于 2 0 0 μl裂解缓冲液中 ,10 0℃水浴 10min后取 10 μl上清液作为聚合酶链反应 (PCR)模板。常规酚 氯仿法提取的PgATCC332 77株、AaY4株、TdFM株和E .coliDH5α株DNA分别作为PCR阳性和阴性对照。采用Pg、Aa和Td 16SrDNA特异性引物 ,建立多重PCR检测上述标本。 3例Pg、Aa和TdPCR结果均阳性标本的目的扩增片段T A克隆后测序。采用 χ2 检验分析不同混合感染情况与牙周炎严重程度之间的关系。结果所建立的多重 16SrDNAPCR最低可检出 10个Pg、2 0个Aa和 2 0个Td细胞。Pg、Aa和Td 16SrDNA扩增片段与已报道的序列比较 ,相似性分别高达 99.4 5 %、97.0 8%和 96 .5 9%。 30名牙周健康者龈沟标本中 ,仅有 1名Pg(3.3% )、2名Aa(6 .7% )的 16SrDNA扩增结果阳性 ,其余标本均阴性。 15 2例CP患者牙周袋标本中 ,14 7例 (96 .7% )检出Pg、Aa和 /或Td的 16SrDNA ,5例 (3.3% )扩增结果均阴性。Pg的PCR检测阳性率 (91.5 % ,139 15 2 )明显高于Aa(72 .4 % ,110 15 2 )或Td(80 .9% ,12 3 15     

大肠杆菌LTKA63突变体的构建及重组LTKA63免疫佐剂活性机理的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)基因减毒突变体LTKA63及其原核表达系统,探讨重组LTKA63(rLTKA63)粘膜免疫佐剂活性的机制。方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA基因,利用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序。采用无His-tag的原核表达载体pET-15b,构建LTKA63原核表达系统,通过SDS-PAGE鉴定表达产物。采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径。结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA基因条带。与报道的LTA序列比较,所克隆的LTA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.03%~99.61%和98.33%~99.22%。LTA基因定位突变后获得序列正确的LT-KA63突变体。rLTKA63表达量占细菌总蛋白的15%左右。rLTKA63作用后Th1和Th2细胞较阴性对照组分别增加21.9%和36.2%。结论本文成功地构建了LTKA63原核表达系统,所表达的rLTKA能同时激活Th1和Th2细胞。     

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

目的:构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统(TCS)基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化.方法:采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统.采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量.免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清.检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化.结果:与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%～99.3%和99.1%～100%.所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coli BL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%.rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8.ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性.结论:本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础.ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关.     

肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。     

大肠杆菌重组LTKA63突变体和LTB黏膜免疫佐剂活性的研究

目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位（heat-labile enterotoxin subunit A,LTA）突变体LTKA63及B亚单位（heat-labile enterotoxin subunit B,LTB）基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性.方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序.构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物.采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力.建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌（Hp）重组尿素酶B亚单位（rUreB）和黏附素（rHpaA）为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用.结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带.LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体.rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30%和20%左右.LTKA63作用后TH1和TH2细胞较阴性对照组分别增加19.9%和42.3%,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合.33.3%（4/12）rUreB和41.7%（5/12）rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性.rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16.7%～25.0%（P＞0.05）,rUreB和rHpaA特异性S-IgA阳性率可达41.6%～58.3%（P＜0.01）.结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性.