淋病奈瑟球菌表面蛋白A基因疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

目的构建淋病奈瑟球菌表面蛋白A（NspA）基因疫苗，并接种小鼠，评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法将NspA基因插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／NspA，并经PCR、双酶切及测序鉴定。反转录一聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法分别检测NspA基因转染细胞后mRNA和蛋白的表达。以pcDNA3．1（＋）／NspA重组质粒免疫45只雄性BALB／c小鼠，试管凝集法检测免疫小鼠抗体滴度，ELISA检测IFN-γ水平，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测脾淋巴细胞增殖。提取接种部位股四头肌总DNA，PCR检测BALB／c小鼠肌细胞内NspA基因。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／NspA基因疫苗，能在真核细胞中转录和表达。pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组的抗体滴度达1：640，pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组均无特异性抗体检出。空载体pcDNA3．1（＋）组IFN-γ为（23．79±11．85）pg／mL，pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组为（169．71±30．52）pg／mL（P〈0．01）；脾淋巴细胞增殖的刺激指数（SI）分别为1．05±0．30和1．94±0．74（P〈0．01）。并证实NspA基因可在小鼠肌细胞中稳定存在。结论构建淋病奈瑟球菌NspA基因疫苗，将其免疫BALB／c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答，为进一步用于淋病预防奠定了基础。     

幽门螺杆菌VacA N端片段通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡

目的:本研究初步探讨幽门螺杆菌(H.pylori)空泡毒素单一毒力决定簇对GES-1胃黏膜上皮细胞凋亡的影响,为进一步研究H.pylori的致病机制奠定基础。方法:将本课题组已构建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表达载体转染至GES-1细胞中,Western blot鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄取试验检测GES-1细胞的空泡样变;Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒以及电镜观察细胞凋亡情况,同时采用分光光度法检测细胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度,Rho123检测细胞跨膜电位的变化,ELISA法检测细胞色素C的释放。结果:重组质粒pDsRed-Monomer-C1/VacA转染GES-1细胞24小时后,电镜下可明显观察到空泡样变及核固缩、染色质边聚等凋亡特征,重组质粒组部分细胞发生空泡样变;Hoechst 33342染色后镜下可见明显的核染色质浓缩,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测发现重组质粒组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);Caspase-9和Caspase-3活化程度呈时间依赖性增加,分别在12小时和24小时达到峰值;Rho123染色发现线粒体跨膜电位明显降低;重组质粒转染组释放细胞色素C的浓度呈时间依赖性正相关,与空质粒组及对照组相比差异显著(P<0.05)。结论:VacA N端片段可诱导GES-1细胞凋亡及空泡样变,VacA蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡。     

生殖支原体脂质相关膜蛋白诱导宫颈上皮细胞表达人β防御素2

目的观察生殖支原体脂质相关膜蛋白(LAMP)能否诱导宫颈上皮细胞表达人β防御素2(hBD-2),并探讨其可能的调控机制。方法体外培养End1/E6E7人宫颈上皮细胞,用不同浓度的LAMP作用细胞48 h,反转录PCR检测hBD-2 mRNA的表达,Western blot法检测hBD-2蛋白的表达;用Toll样受体2(TLR2)和TLR6中和抗体孵育End1/E6E7细胞,并用TLR2、TLR6和MyD88负显性突变体转染细胞,以明确TLR2、TLR6和MyD88在介导hBD-2表达中的作用;Western blot法检测核因子κB(NF-κB)p65亚基核转位情况,电泳迁移率实验(EMSA)分析LAMP处理前后NF-κB的DNA结合活性;采用NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)处理,观察对hBD-2表达的影响。结果生殖支原体LAMP可诱导End1/E6E7细胞表达hBD-2mRNA和蛋白。TLR2和TLR6中和抗体以及其负显性突变体转染后,能降低hBD-2表达;MyD88负显性突变体也能显著抑制LAMP诱导的hBD-2表达。Western blot结果显示,LAMP处理后可诱导p65核转位,并能增强NF-κB的DNA结合活性。而NF-κB抑制剂PDTC处理后,hBD-2表达降低。结论生殖支原体LAMP可诱导End1/E6E7细胞表达hBD-2,可能受TLR2、TLR6/MyD88/NF-κB调控。     

人型支原体Ⅱ型拓扑异构酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物关系的研究

我们从 10 3株临床株中筛选出 8株对 6种氟喹诺酮类药物呈不同程度交叉耐药的人型支原体 (Mh)株 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增喹诺酮耐药决定区 (QRDR)。报告如下。一、材料与方法1.标本收集 :2 0 0 1年 4～ 8月从性病门诊收集泌尿生殖道感染患者的分泌物标本 5 12份 ,按文献 [1]方法 ,共分离鉴定出 10 3株Mh。2 .抗菌药物 :粉剂诺氟沙星 (NFX)、氧氟沙星 (OFX)、左氧氟沙星 (LFX)、环丙沙星 (CFX)、加替沙星 (GFX)和司帕沙星 (SFX)由浙江医药股份有限公司新昌制药厂惠赠。3.药敏试验和模板DNA提取 :均按文献 [1]方法。耐药株的M…     

GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位

目的 研究GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.方法 PCR扩增HPV16E5基因片段,将其连接到真核表达截体pEGFP-C1,双酶切及测序鉴定,构建表达截体pEGFP-C1/HPV16 E5;将质粒pEGFP-C1/HPV16 E5和pEGFP-C1分别转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下现察GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.结果 GFP 荧光均匀分布在细胞浆和细胞核;GFP-HPV16 E5融合蛋白组荧光分布在细胞浆.结论 GFP-HPV16 E5融合蛋白能在HeLa细胞内表达且定位于细胞浆.     

支原体巨噬细胞活化脂肽-2经PI3K/Nrf2诱导单核细胞表达HO-1和NQO1

目的 观察支原体巨噬细胞活化脂肽-2（MALP-2）对THP-1单核细胞血红素氧合酶-1（HO-1）和NAD（P）H：醌氧化还原酶-1（NQO1）表达的影响,以明确机体抵抗支原体感染所致炎性损伤的自我防御机制.方法 体外培养THP-1细胞并分为对照组和实验组.其中对照组加入等体积培养基,实验组根据不同的实验目的 加入不同浓度的MALP-2作用5～120 min或12 h,Western blot 检测HO-1和NQO1表达以及Akt磷酸化水平.同时,采用PI3K抑制剂LY294002处理细胞,以证实PI3K参与HO-1表达.提取细胞核蛋白,凝胶迁移率实验和免疫荧光观察NF-E2相关因子2（Nrf2）的DNA结合活性和核转位情况,并采用特异性siRNA沉默Nrf2后,Western blot观察其对HO-1和NQO1表达的影响.结果 Western blot结果显示,MALP-2能诱导THP-1细胞表达HO-1和NQO1蛋白,且呈一定的剂量依赖性.此外,MALP-2能激活PI3K,且PI3K抑制剂能抑制HO-1和NQO1的表达;凝胶迁移率实验和激光共聚焦结果显示,MALP-2能增强Nrf2的DNA结合活性及核转位,而PI3K抑制剂处理后,Nrf2的DNA结合活性以及核转位水平进一步降低.RNA干扰Nrf2后,HO-1和NQO1表达显著降低.结论 MALP-2能诱导THP-1细胞表达HO-1和NQO1,其机制可能受PI3K/Nrf2调控.     

肺炎支原体P1C-IL-2融合基因疫苗鼻饲对小鼠免疫效果的检测

目的 研究肺炎支原体(Mp) P1C-IL-2融合基因疫苗经鼻饲免疫小鼠后的免疫应答水平和免疫保护作用,了解IL-2对P1C核酸疫苗的免疫佐剂效应.方法 将构建的P1C-IL-2核酸疫苗鼻饲免疫BALB/c鼠,ELISA检测免疫小鼠血清IgG滴度、IgG亚类和支气管肺泡灌洗液中IgA及IFN-γ、IL-4的水平;建立小鼠Mp感染模型,观察Mp攻击后小鼠肺组织炎症情况和支气管肺泡灌洗液中Mp菌落数的变化.结果 P1C-IL-2双基因疫苗组小鼠血清中的总IgG、IgG1、IgG2a亚类和支气管肺泡灌洗液中IFN-γ和IL-4水平均较PIC疫苗组小鼠显著增高(P＜0.05),但两组支气管肺泡灌洗液IgA差异无显著性(P＞0.05).用Mp滴鼻感染免疫小鼠,第1、3、6天P1C-IL-2双基因融合疫苗组小鼠肺组织炎症病理评分显著高于P1C单基因疫苗免疫组小鼠,两组小鼠支气管肺泡灌洗液中的Mp菌落数差异无显著性(P＞0.05).结论 IL-2能显著增强PIC疫苗的免疫应答水平,但在感染早期也激发了较强的肺组织炎症.     

IL-2增强肺炎支原体P1C核酸疫苗的肌注免疫效果

目的:研究IL-2对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1C核酸疫苗经肌注免疫BALB/c小鼠后的免疫应答水平和免疫保护作用.方法:将P1C-IL-2核酸疫苗肌注免疫BALB/c鼠,ELISA检测疫苗免疫后56天小鼠血清IgG和IgG亚类、支气管灌洗液中SIgA、IFN-γ和IL-4的水平;用2×107 Mp菌落形成单位鼻饲感染BALB/c鼠,建立感染小鼠模型,病理切片检测Mp感染后小鼠肺部炎症病理改变;将系列10倍稀释的支气管灌洗液接种于SP4固体平板,并进行菌落计数.结果:P1C-IL-2核酸疫苗免疫组小鼠血清中的总IgG、IgG1、IgG2a、IFN-γ和IL-4水平均较P1C单基因疫苗组显著增高(P＜0.05),但两组支气管灌洗液中SIgA差异无显著性(P＞0.05).Mp感染后第1、3、6天P1C-IL-2双基因疫苗组小鼠肺组织病理评分(HPS)较P1C单基因疫苗免疫组显著增高,但支气管灌洗液中的Mp菌落数明显减少;第9天后两组HPS和Mp菌落数差异无显著性.结论:IL-2能显著增强P1C疫苗肌注的免疫保护作用和免疫应答水平,但同时在Mp感染早期激发了较重的肺组织炎症.     

Daxx与PML在HeLa和Caski细胞株中的定位观察

目的 分析宫颈癌细胞内早幼粒细胞白血病蛋白(PML)和死亡域相关蛋白(Daxx)的定位,为进一步研究高危型HPV16和HPV18的致癌机制奠定试验基础.方法 培养HeLa细胞和Caski细胞,利用间接免疫荧光试验,在激光共聚焦显微镜下观察并分析PML和Daxx在细胞内的定位;分析Caski细胞中Daxx与HPV16 E6蛋白定位.结果在HeLa细胞和Caski细胞,PML红色信号和Daxx绿色信号在胞核和胞浆呈弥散样均匀分布;Daxx绿色信号与PML红色信号重叠时,依然显示各自的绿色信号与红色信号.在Caski细胞,HPV16 E6和Daxx在细胞中分布不均匀,呈区域性聚集;表达红色信号的HPV16 E6与表达绿色信号的Daxx重叠成黄色信号.结论 在Caski细胞和HeLa细胞,PML定位于细胞核的PML-NBs;Daxx在胞核和胞浆呈弥散样均匀分布;两者未发生共定位.Daxx与HPV16 E6蛋白在Caski细胞共定位于胞浆与胞核.     

半巢式聚合酶链反应扩增全血中梅毒螺旋体polA基因

目的探讨半巢式聚合酶链反应（PCR）扩增梅毒螺旋体（Tp）的DNA多聚酶Ⅰ基因（polA）以探讨检测全血标本中微量Tp的可行性。方法应用半巢式PCR和常规PCR分别扩增165例可疑梅毒及非梅毒患者全血中Tp的polA,与血清学方法比较,探讨半巢式PCR方法在扩增全血中Tp DNA的意义。结果待测的165例标本中,与血清学方法比较,半巢式PCR检测Tp的敏感性和特异性分别为62.7%和95.9%,两者符合率为82.4%;两种PCR方法检测结果差异有显著性（P〈0.01）,半巢式PCR敏感性远高于常规PCR。结论半巢式polA PCR检测全血中Tp较常规PCR灵敏,是血清学方法诊断梅毒的有效补充,但其检测的灵敏度仍有待进一步提高。