大青转录组测序及生物信息学分析

【目的】利用高通量测序技术获得大青的转录组信息特征。【方法】通过高通量测序平台Illumina HiSeq;2500对大青进行转录组测序,采用Trinity软件de novo组装获得Unigene,并基于序列同源性对Unigene进行功能注释,得到大青转录组的遗传信息。【结果】测序数据经过质控后共获得26 394 223个高质量的Reads,通过de novo组装获得100 191个Unigene,N50长度为1 055 bp,平均长度724.4 bp。其中59 690个(59.58%)Unigene在NR、SwissProt、KOG、GO、KEGG数据库中均得到注释。其中KEGG数据库注释到38 260个Unigene,涉及136条代谢通路。在大青转录组中共鉴定到407个Unigene参与萜类化合物的生物合成,165个Unigene涉及类黄酮生物合成,29个Unigene参与黄酮和黄酮醇生物合成,37个Unigene参与异黄酮生物合成,同时,还鉴定到210类转录因子。MISA分析发现6 680个Unigene包含8 640个简单重复序列。【结论】利用高通量测序技术和生物信息分析获得了大青的转录组信息特征,这些数据可为后期开展功能基因鉴定、解析黄酮类化合物次生代谢途径及其调控机制奠定研究基础。     

罗浮山百草油抗炎作用机制及活性组分筛选研究

目的：研究罗浮山百草油体内及体外抗炎作用的药效及作用机制并初步筛选其活性组分。方法：分别使用二甲苯致小鼠耳肿胀法及脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性模型检测罗浮山百草油的体内及体外抗炎作用,使用RT-PCR法及ELISA法检测细胞内炎性因子变化;通过脂多糖LPS诱导人急性单核细胞白血病细胞THP1炎性模型,使用Western blot法检测核因子-κB p65（nuclear factor κB p65,NF-κB p65）及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）的磷酸化水平。将罗浮山百草油分为13个组分,使用LPS诱导RAW264.7细胞炎性模型初步筛选其活性组分。结果：罗浮山百草油可剂量依赖性地抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀及LPS诱导RAW264.7细胞一氧化氮（nitric oxide,NO）的产生,抑制细胞内白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS） mRNA和IL-1β、IL-6蛋白的表达;罗浮山百草油可抑制LPS诱导THP1细胞NF-κB p65及p38 MAPK的磷酸化。活性组分初步筛选发现,13个组分中,百草精（68种药材的茶油提取物）、丁香罗勒油、肉桂油以及八角茴香油具有较强的抗炎活性,是罗浮山百草油抗炎活性的主要贡献者。结论：本研究证实了罗浮山百草油抗炎活性的有效性,并筛选出了相应活性组分,可为临床应用及质量控制提供依据。     

大青转录组测序及生物信息学分析

【目的】 利用高通量测序技术获得大青的转录组信息特征。【方法】 通过高通量测序平台Illumina HiSeqTM 2500 对大青进行转录组测序,采用Trinity软件de novo组装获得Unigene,并基于序列同源性对Unigene 进行功能注释,得到大青转录组的遗传信息。【结果】 测序数据经过质控后共获得26 394 223个高质量的Reads,通过de novo组装获得100 191个Unigene,N50长度为1 055 bp,平均长度724.4 bp。其中59 690个（59.58%）Unigene 在NR、SwissProt、KOG、GO、KEGG数据库中均得到注释。其中KEGG数据库注释到38 260个Unigene,涉及136条代谢通路。在大青转录组中共鉴定到407个Unigene参与萜类化合物的生物合成,165个Unigene 涉及类黄酮生物合成,29个Unigene参与黄酮和黄酮醇生物合成,37个Unigene参与异黄酮生物合成,同时,还鉴定到210类转录因子。MISA分析发现6 680个Unigene 包含8 640个简单重复序列。【结论】 利用高通量测序技术和生物信息分析获得了大青的转录组信息特征,这些数据可为后期开展功能基因鉴定、解析黄酮类化合物次生代谢途径及其调控机制奠定研究基础。     

咳特灵片HPLC指纹图谱研究

目的:建立咳特灵片的HPLC指纹图谱研究方法,为咳特灵片的质量标准提出修订建议。方法:采用Kromasil C₁₈柱(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B)为流动相,梯度洗脱,体积流量1.0 mL·min^-1,柱温35℃,检测波长270 nm,建立咳特灵片指纹图谱。以异牡荆苷为参照峰,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012A版)对市售55批咳特灵片进行相似度评价。结果:建立的咳特灵片指纹图谱共确定了11个共有峰,通过对照品指认了9个特征峰化学成分,55批次样品相似度在0.837~0.998之间,平均值为0.984,考虑到药材的来源及大生产带来的影响,认为供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.90较为合理。结论:建立了咳特灵片的HPLC指纹图谱,该法简便、准确、重现性好,可用于咳特灵片的质量控制。     

一测多评分析方法下柴胡药材中柴胡皂苷a、c、d含量测定研究

目的:用一测多评法对柴胡药材中柴胡皂苷a、c、d的含量进行测定研究。方法:采取一测多评分析方法,以柴胡皂苷a(SSa)做对照样品,并以此建立起药材中此成分与柴胡皂苷c(SSc)、d(SSd)的相对校正因子,由此计算出柴胡药材中柴胡皂苷c、d的含量,除此之外,采取外标法测定该药材中三种成分的绝对含量,通过统计学检验的方法对一测多评法的测量结果进行比较,并由此评价一测多评法测量柴胡药材中柴胡皂苷a、c、d含量的科学性和准确性。结果:在一定范围内,柴胡药材中柴胡皂苷a与柴胡皂苷c、d的相对校正因子分别为0.747和0.955,且实验条件的改变对结果影响较小(RSD=0.75%,0.58%);经检验,外标法与一测多评法的测量结果差异并无统计学意义(P0.05),即一测多评法所得到的校正因子符合真实情况。结论:用一测多评分析方法测定柴胡药材中柴胡皂苷a、c、d的含量所得的结果真实可信,为柴胡药材多指标质量控制及评价提供了科学依据。     

复方穿心莲片HPLC指纹图谱研究

目的：建立复方穿心莲片指纹图谱研究方法,为复方穿心莲片的质量标准提出修订建议。方法：采用Thermoscientific Syncronis aQ C18（4.6 mm × 250 mm,5 μm）色谱柱,以乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）为流动相,梯度洗脱;以270 nm为检测波长,柱温为30 ℃,流速为1.0 mL·min-1,建立复方穿心莲片指纹图谱,利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”对市售65批次复方穿心莲片进行相似度评价。 结果：建立的复方穿心莲片指纹图谱共确定6个共有峰,65个批次相似度在0.449~0.994之间差异较大,平均值为0.927,考虑到药材的来源及大生产带来的影响,认为供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度应不得低于0.90较为合理。结论：本方法稳定可控,可用于复方穿心莲片的质量控制。     

宫炎平片的遗传毒性试验研究

目的在体外条件下研究宫炎平片(GYP)是否具有遗传毒性,为临床用药安全提供依据。方法对GYP设不同剂量组,选用Ames试验、体外CHL细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验进行遗传毒性试验。结果Ames试验各组平皿均未见细菌毒性表现,结果为阴性。CHL试验中24 h后采样以及48 h后采样,所有剂量的细胞染色体畸变率均未显著增高,GYP无抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变的能力,微核试验结果为阴性无统计学意义(P>0.05)。结论综合以上3个试验结果,认为在实验条件下,GYP无遗传毒性。     

罗浮山百草油体外抗腺病毒研究

摘要：目的:研究罗浮山百草油（LHO）体外抗腺病毒感染的作用。方法:采用细胞病变CPE法及噻唑蓝（MTT）法检测LHO对于Hep-2细胞的安全剂量,同法检测腺病毒感染及LHO给药前后对腺病毒体外感染的抑制作用。结果:MTT法测得LHO对Hep-2细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)为92.41μg·ml-1;腺病毒感染Hep-2细胞后7 d,细胞产生明显病变,LHO给药后能够明显抑制腺病毒感染引起的细胞病变;MTT法测得LHO对腺病毒半数抑制率(EC50)为55.18μg·ml-1,选择指数（SI）为1.67。结论:LHO可以抑制腺病毒的体外感染引起的细胞活性降低及细胞病变。