TIMP-1表达在实验性大鼠肝纤维化发病中的作用

目的　探讨TIMP 1表达在实验性大鼠肝纤维化发病中的意义及外源性IL 10抗肝纤维化作用的可能机制。方法　 60只SD雄性大鼠随机分为生理盐水对照组 (N组 ,8只 )、CCl4组 (C组 ,2 8只 )和IL 10干预组 (Ⅰ组 ,2 4只 ) ,建立下常对照、CCl4诱导肝纤维化模型及IL 10干预模型。造模第 7周和第 11周 ,采用链霉蛋白酶E、Ⅳ型胶原酶经门静脉原位灌流消化 ,11%Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞 (HSC)。半定量RT PCR法检测各组HSC的TIMP 1mRNA表达水平 ;免疫细胞化学法检测培养贴壁后HSC的TIMP 1蛋白表达情况。结果　各组均检出TIMP 1的mRNA表达 ;造模第 7周 ,C组与I组的TIMP 1mRNA表达均高于N组 (P <0 .0 1) ,I组低于C组 (P <0 .0 1) ;造模第 11周 ,I组明显低于C组 (P <0 .0 1) ,C组TIMP 1的表达水平较第 7周进一步增加 (P <0 .0 1) ,而I组有所下降 (P <0 .0 5 )。免疫细胞化学法检测各组TIMP 1的蛋白表达变化与mRNA表达变化一致。结论　TIMP 1随着大鼠肝纤维化进展表达逐渐升高 ,IL 10通过抑制TIMP 1的表达 ,起抗纤维化作用     

白细胞介素-10对肝星状细胞增殖及表达Fas/Fas配体的影响

研究拟通过观察外源性血小板衍生生长因子(PDGF)和白细胞介素-10(IL-10)干预后肝星状细胞(HSC)增殖及凋亡相关基因Fas/FasL表达的变化,进一步探讨PDGF致纤维化和IL-10抗肝纤维化的机制。     

白细胞介素-10基因修饰对大鼠肝细胞系BRL生长的影响

目的：观察白细胞介素-10（IL-10）基因修饰对大鼠肝细胞增殖、凋亡的影响,并筛选出表达可能受影响的细胞因子.方法体外培养大鼠肝细胞系BRL ,分为对照组（C组）,转染 pcDNA3.0空质粒（P组）,转染pcDNA3.0-rIL-10重组质粒（I组）.M T T法检测其增殖,流式细胞法检测其凋亡,抗体芯片法检测其细胞因子的表达.结果转染48 h后,P组较C组增殖减少（ P=0.000）,凋亡增加（ P=0.000）;I组较P组增殖差别无统计学意义（ P=0.279）,但凋亡明显减少（ P=0.000）.抗体芯片显示I组较P组除IL-10表达增加之外,血管表皮生长因子（VEGF）的表达下调.结论 IL-10基因治疗肝纤维化中,将肝细胞做为IL-10基因的表达细胞具有可行性.IL-10基因修饰后,肝细胞除了高表达IL-10之外,还通过下调VEGF的表达间接作用.     

大鼠IL-10基因真核表达质粒的构建及其在BRL细胞中的表达

目的:构建大鼠IL-10基因的真核表达载体,观察其在大鼠肝细胞系BRL中的表达,比较有无受体介导的脂质体的转染效率.方法:抽提外周血单个核细胞的总RNA,通过RT-巢式PCR方法获得大鼠IL-10的全长编码序列,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0,并进行限制性内切酶酶切及测序鉴定.将重组质粒分别通过脂质体TransfastTM与去唾液酸糖蛋白受体介导的脂质体PEIjet-gal转入大鼠肝细胞系BRL,通过RT-PCR方法检测IL-10 mRNA的表达,比较二者的转染效率,用ELISA法检测后者分泌型IL-10的表达.结果:经酶切及测序鉴定证实,重组质粒插入片段与大鼠IL-10的全长编码序列完全相符.发现受体介导的脂质体PEIjet-gal转染效率明显高于非受体介导的脂质体TransfastTM .通过受体介导的脂质体转染,BRL细胞获得高水平的IL-10表达.结论:成功地构建pcDNA3.0-IL-10重组质粒.受体介导的脂质体对肝细胞有较高的转染活性,可能成为IL-10基因治疗肝纤维化的有效转染载体.     

胰岛素样生长因子-1受体在实验性肝纤维化中的表达及IL-10的干预作用

目的 观察胰岛素样生长因子－1受体（IGF－1R）在实验性大鼠肝纤维化过程中的表达情况及白细胞介素－10（IL－10）对肝纤维化大鼠IGF－1R表达的影响。方法 建立CCl4诱导大鼠肝纤维化模型并行IL－10干预实验。取对照组、模型组及IL－10干预组大鼠肝脏组织，采用SP免疫组织化学方法检测分析在肝纤维化进程不同阶段大鼠肝组织IGF－1R4的表达情况。结果 经CCl4诱导成功建立大鼠肝纤维化模型。随着肝纤维化程度的加重，IGF－1R在肝组织中阳性表达明显增强；经Ridit分析，对照组与模型组IGF－1R阳性表达差异有显著性（P＜0．01）；IL－10干预组IGF－1R阳性表达较模型组明显减弱，差异有显著性（P＜0．05），且随IL－10干预时间的延长，IGF－1R在肝组织中阳性表达逐渐减弱。结论 随着肝纤维化程度的进展IGF－1R阳性表达增强，外源性IL－10可降低CCl4诱导大鼠肝纤维化中IGF－1R的表达。     

白介素-10与血小板衍生生长因子-BB对肝星状细胞表达细胞间黏附分子-1 mRNA的影响

目的 :探讨白介素 10 (IL 10 )、血小板衍生生长因子 BB (PDGF BB)对体外活化的培养大鼠肝星状细胞(HSC)表达细胞间黏附分子 1(ICAM 1)mRNA的影响。方法 :体外培养激活的HSC (细胞系rHSC 99)随机分为 4组 :对照组 (A组 )、IL 10 2 0ng/ml干预组 (B组 )、PDGF BB 2 0ng/ml干预组 (C组 )及IL 10 2 0ng/ml PDGF BB2 0ng/ml共干预组 (D组 )。加药后 2 4小时 ,采用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR )方法 ,检测各组ICAM 1mRNA表达情况。结果 :B组ICAM 1mRNA的表达较A组明显降低 (P <0 0 1) ;C组ICAM 1mRNA的表达较A组明显增强 (P <0 0 1) ;D组ICAM 1mRNA的表达较A组与C组均降低 (P <0 0 5 ,P <0 0 1) ,但与B组相比较其ICAM 1mRNA的表达则增强 (P <0 0 1)。结论 :PDGF BB促进肝纤维化与其引起HSC表达ICAM 1增强有关 ,IL 10通过下调HSCICAM 1表达 ,可在抑制肝纤维化中发挥作用。     

大鼠肝细胞对肝星状细胞增殖与活化的影响及其机制探讨

目的观察肝细胞对原代肝星状细胞（HSC）增殖、表型、胶原表达等生物学特性的影响，并为探讨其作用机制提供线索。方法原位灌流分离大鼠HSC，与大鼠肝细胞系BRL共培养48h。在相差显微镜下观察HSC的表型变化，用Westernblot方法检测其α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型前胶原的表达，TUNEL方法检测其凋亡。取BRL细胞的培养上清液培养原代HSC，用MTT法检测其增殖。采用抗体芯片投水碌示BRL细胞的培养上清液与对照培养基之间细胞凶子的表达差异。结果BRL细胞的培养上清液明显促进HSC增殖（P〈0．01）。与BRL细胞共培养的原代HSC胞体收缩性增强，Ⅰ型前胶原及α-SMA的表达上调，凋亡增加（P〈0．01）。较对照培养基，BRL细胞的培养上清液中帆管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-1）等三种细胞因子显著上调。结论肝细胞可促进原代HSC的增殖与活化，其机制可能与肝细胞分泌VEGF、MCP-1、TIMP-1等细胞因子有关。     

肝脏靶向表达大鼠白介素-10基因对猪血清诱导的大鼠肝纤维化的抑制

目的 探讨肝脏靶向表达rIL-10基因对猪血清诱导的大鼠肝纤维化的抑制作用.方法 rIL-10基因通过尾静脉快速大容量注射法转移至大鼠体内,RT-PCR法检测大鼠肝、肾、脾和肺组织rIL-10 mRNA的表达及S-P免疫组化法检测rIL-10蛋白在肝脏中表达.30只体质量100～120 g清洁级雄性SD大鼠按随机数字表...     

分泌型rIL-10基因在正常大鼠肝细胞系BRL中的稳定表达

目的:建立稳定表达分泌型大鼠白细胞介素10(rIL-10)基因的正常大鼠肝细胞系(BRL细胞),为研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础.方法:通过RT-巢式PCR技术从大鼠外周血单核细胞(PBMC)中扩增出rIL-10全长基因,克隆入pcDNA3真核表达载体构建重组表达载体pcDNA3-rIL-10.鉴定正确后,用受体介导的脂质体转染试剂将pcDNA3-rIL-10转染BRL细胞,高浓度G418筛选,RT-PCR及ELISA法证实rIL-10在BRL细胞中的稳定表达.结果:构建的真核表达载体pcDNA3-rIL-10经质粒双酶切及测序鉴定证实载体构建的正确性.RT-PCR及ELISA法检测出经G418筛选的BRL细胞稳定表达IL-10.结论:成功构建分泌型pcDNA3-rIL-10真核表达质粒及筛选出稳定表达分泌型rIL-10的BRL细胞株,为进一步研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础.     

IL-10对实验性肝纤维化大鼠血小板衍生生长因子-AA、BB表达的影响

目的:探讨IL-10干预对肝纤维化大鼠表达血小板衍生生长因子-AA、BB(PDGF-AA、BB)的影响。方法:建立大鼠肝纤维化模型并行IL-10干预。分批从对照组(C组)和CCl_4诱导肝纤维化模型组(M组)及IL-10干预肝纤维化组(T组)中取肝脏组织,采用S-P免疫组织化学方法检测分析PDGF-AA、BB在肝纤维化进程中的表达状况和IL-10干预后不同组大鼠及同组不同阶段大鼠肝组织中的表达结果。结果:成功建立大鼠肝纤维化模型小组肝组织中PDGF-AA、BB阳性表达明显增强,且PDGF-BB阳性表达强度高于PDGF-AA。经Ridit分析,两者在C组与M组间比较阳性表达均有显著性差异(P<0.01);T组与M组间比较PDGF-AA无统计学差异,但T组的PDGF-BB较M组明显减弱;PDGF-BB在肝纤维化组与IL-10干预组不同阶段阳性表达差异均有显著性。结论:PDGF-BB阳性强度随肝纤维化进展表达增强,而抑制PDGF-BB的表达可能是外源性IL-10拮抗肝纤维化的机制之一。