EB病毒gp85 N端片段的原核表达与初步鉴定

目的：构建EB病毒基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85N端截短片段的抗原性。方法：采用基因工程技术，以B95—8细胞（美洲绒猴外周血B淋巴细胞经EBV转化后的细胞系）培养上清为模板，用PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片段。PCR产物经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切，插入原核表达载体pGEX-5T中，构建pGEX5T-85N重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白用Westernblot鉴定，并免疫BALB／c小鼠。结果：序列分析表明，插入片段的序列与GenBank登录的参考序列完全一致。重组表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为45000，同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB／c小鼠，经ELISA检测获得了高效价的抗血清，且抗gp85单克隆抗体（mAb）可识别所表达的gp85N抗原。Westernblot显示，该抗原可与小鼠免疫血清起特异性反应。结论：表达并纯化的EB病毒截短的gp85N重组蛋白具有良好的抗原性，为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供了条件。     

血小板反应素mRNA表达、血浆PF4水平与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的关系

目的探讨血小板反应素(TSP)mRNA表达、血浆血小板第4因子(PF4)水平与甲状腺乳头状癌(PTC)颈部淋巴结转移的关系。方法应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测40例PTC癌组织和10例癌旁正常组织TSP-1、TSP-2 mRNA的表达,并用酶标记免疫分析法(ELISA)测定40例PTC患者、20例健康体检者(对照组)的血浆PF4水平。结果(1)PTC癌组织TSP-1 mRNA、TSP-2 mRNA阳性表达率分别为45.0%、47.5%,它们均明显低于正常组织(80.0%)(P<0.01),而且TSP-1 mRNA、TSP-2 mRAN阳性表达PTC组的颈部淋巴结转移率均明显低于TSP-1 mRNA、TSP-2 mRNA阴性表达PTC组(33.3% vs 90.9%、42.1% vs 85.7%,P<0.01)。(2)正常对照组、无淋巴结转移的PTC组和伴淋巴结转移的PTC组间的PF4血浆浓度呈线性递减趋势,其中无淋巴结转移组的PF4血浆浓度(2.96±0.21)μg/L高于转移组(0.98±0.17)μg/L(P<0.05)。(3)TSP-1 mRNA、TSP-2 mRNA阳性表达PTC组的血浆PF4水平分别明显高于TSP-1 mRNA、TSP-2 mRNA阴性表达组[(2.36±0.91)μg/L vs(1.11±0.60)μg/L,(2.15±1.00)μg/L vs(1.23±0.72)μg/L](P<0.01)。结论缺乏TSP-1 mRNA、TSP-2 mRNA表达及血浆低水平的PF4诸因素可能为促进PTC发生颈部淋巴结转移起到了推波助澜的作用,TSP-1、TSP-2与PF4在抑制PTC颈部淋巴结转移中起着互相协同的作用。     

TSPmRNA表达、血浆PF4水平与甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的关系

目的 探讨血小板反应素(TSP)mRNA表达、血浆血小板第四因子(PF4)水平与甲状腺乳头状癌(PTC)颈部淋巴结转移的关系.方法 应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测40例VIE癌组织和10例癌旁正常组织TSP1和TSP2mRNA的表达,并用酶标记免疫分析法(ELISA)测定40例PIE患者、20例健康体检者(对照组)的血浆PF4水平.结果 (1)PIE癌组织TSP1mRNA、TSP2mRNA阳性表达率分别为45%、47.5%,它们均明显低于正常组织(80%)(P＜0.01),而且TSP1mRNA、TSP2mR.NA阳性表达PTC组的颈部淋巴结转移率均明显低于TSP1mR.NA、TSP2mRNA阴性表达PTC组(33.3%vs 90.9%、42.1%vs 85.7%,P＜0.01).(2)正常对照组、无淋巴结转移的PTC组和伴淋巴结转移的PTC组间的PF4血浆浓度呈线性递减趋势,其中无淋巴结转移组的PF4血浆浓度(2.96±0.21ng/ml)高于转移组(0.98±0.17 ng/ml)(P＜0.05).(3)TSP1mRNA、TSP2mRNA阳性表达VTC组的血浆PF4水平分别明显高于TSP1mRNA、TSP2mRNA阴性表达组(2.36±0.91 ng/ml vs 1.11±0.60 ng/ml,2.15±1.00 ng/ml vs 1.23±0.72 ns/ml)(P＜0.01).结论 缺乏TSP1mRNA、TSP2mRNA表达及血浆低水平的PF4诸因素可能为促进PTC发生颈部淋巴结转移起到了推波助澜的作用,TSP1、TSP2与PF4在抑制PTC颈部淋巴结转移中起着互相协同的作用.     

hPF4 mRNA表达与甲状腺乳头癌血管生成、转移的关系

 目的 研究甲状腺乳头癌组织中人血小板第IV因子（human platelet factor 4 hPF4）表达与微血管密度（MVD）与淋巴结转移之间的关系。方法 对40例甲状腺乳头癌手术标本和10例癌旁正常组织标本采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测hPF4 mRNA表达，并采用CD105单克隆抗体标记免疫组化法检测微血管密度。结果 正常组织hPF4 mRNA阳性率为80 %；癌组织hPF4阳性率为47.5 %，表达组MVD （25.4±11.7）低于不表达组（45.1±11.9），MVD存在显著性差异（t值为2.64，均P＜0.01），hPF4 mRNA阳性表达率在发生淋巴结转移的病例显著低于没发生转移的病例（χ2 = 9.42，P＜0.01）。结论 甲状腺乳头癌组织TSPmRNA表达可降低MVD和抑制淋巴结转移。     

病毒白细胞介素-10的基因克隆与原核表达

目的:构建病毒白细胞介素IL-10(vIL-10)基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:以EB病毒B95-8细胞培养上清为模板,用PCR扩增EB病毒BCRF1基因。PCR产物经EcoRI和XhoI双酶切后,克隆至原核表达载体pET-28a中,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,在IPTG诱导下表达目的蛋白。结果:以终浓度为100μmol/L的IPTG于30℃诱导6h后,重组菌可高效表达相对分子质量(Mr)约为24000的His-vIL-10融合蛋白。结论:成功地克隆vIL-10的编码基因并在大肠杆菌中高效表达,为制备抗vIL-10单克隆抗体(mAb)、分析vIL-10结构与功能的关系提供了条件。     

肝癌细胞系BEL-7402中siRNA表达载体介导靶向c-myc基因的RNA干涉实验研究

Objective： To explore the inhibition of the expression of c-Myc in human hepatocellular carcinoma via vector-based RNA interference （RNAi）. Methods： Two RNA interference DNA templates targeting c-Myc oncogene were designed via online software and synthesized. By ligation, the fragments were inserted into pSilencer 1.0-U6 to construct the recombinant siRNA expressing plasmids. The identified recombinants were introduced into BEL-7402 cells with Lipofactamine. The inhibition of c-Myc expression, together with the expression of CDK4, hTERT and Gadd45β in c-Myc down-regulated BEL-7402 cells, were analyzed by semi-quantitative RT-PCR. Results： Two recombinant plasmids pSic-myc-1 and pSic-myc-2, which direct the yields of siRNAs targeting c-Myc in cells, were constructed. Among which, pSic-myc-2 was shown to trigger a RNAi-mediated inhibition of expression of c-Myc in BEL-7402 by up to 90%. In c-Myc knockdown BEL-7402 cells, the expression of CDK4 and hTERT were down-regulated with a ratio of 85% and 57%, respectively, while the expression of Gadd45β was up-regulated by up to 110%. Conclusion： The expression of c-Myc in BEL-7402 could be suppressed by vector-based RNA interference successfully. The knockdown of c-Myc in turn resulted in the changes of expression of genes related to cell proliferation and apoptosis. Thus, our study provided a preliminary data in searching of a c-Myc-targeted RNAi therapy of human hepatocellular carcinoma.     

外周血白细胞淋巴细胞功能相关抗原-1表达对受者肾移植前后的作用

目的监测肾移植前后外周血白细胞淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的表达水平,了解其变化规律,探讨其在移植排斥反应中的意义.方法应用单克隆抗体-流式细胞术荧光抗体技术监测肾移植受者外周血白细胞淋巴细胞LFA-1表达水平.结果肾移植术后LFA-1表达水平较术前显著降低,并维持在低水平,发生排斥反应时显著升高,排斥时LFA-1表达水平与术后无排斥时及排斥反应控制后LFA-1比较差异有显著性,与术前比较差异无显著性.结论LFA-1在白细胞淋巴细胞上表达与排斥反应密切相关,监测LFA-1的表达水平有助于肾移植排斥反应的诊断.     

甲状腺乳头状癌uPA表达和微血管密度与颈部淋巴结转移的关系

目的探讨血管新生和(或)尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-typeplasmino-genactivator,uPA)的表达与甲状腺乳头状癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)颈部淋巴结转移的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测PTC中uPA的表达和以CD105抗体标志的微血管密度(microvesseldensity,MVD)。结果有颈部淋巴结转移和无淋巴结转移的PTC的uPA阳性表达率分别为72.89%(43/59)和38.71%(12/31),两组间差异有统计学意义,χ2=9.96,P=0.002。59例有颈部淋巴结转移PTC的MVD值(76.18±4.98)显著高于31例无淋巴结转移者的MVD值(38.01±3.92),t=37.03,P=0.000。uPA阳性表达且具有高MVD的PTC的淋巴结转移率为92.50%,明显高于uPA阳性表达但具有低MVD组(46.67%)、uPA阴性表达但具有高MVD组(50.00%)和uPA阴性表达且具有低MVD组(40.74%),χ2=23.45,P=0.000。结论活跃的血管生成和uPA的过表达与PTC颈部淋巴结转移的发生密切相关,PTC中uPA过表达且具高MVD者越容易发生颈部淋巴结转移,这对临床筛选高危淋巴结转移病例具有重要的指导意义。     

p53蛋白三维空间结构改变与甲状腺乳头状瘤p21WAF1/CIP1蛋白定量表达关系的研究

目的：从结构分子生物学深度探讨p53蛋白三维空间结构改变与甲状腺乳头状癌（PTC）及甲状腺滤泡性腺瘤（TFA）中p21^WAF1/CIP1。蛋白定量表达的关系。方法：采用PCR-SSCP、DNA序列分析、计算机重构p53蛋白三维空间结构和有关分析软件、免疫组织化学和图像分析等技术进行研究。根据p53基因Exon5—8突变与否把PTC划分为Ⅰ组（p53基因突变组）和Ⅱ组（无p53基因突变组），再根据突变型p53蛋白三维构象改变的空间位点不同，把Ⅰ组分为ⅠA和ⅠB组。结果：Ⅱ组和ⅠA组的阳性细胞的平均积分光密度值（MOD）差异无统计学意义，两者均数差1．26，P〉0．05。Ⅲ组（TFA组）和Ⅱ组、Ⅲ组和ⅠB组、Ⅲ组和ⅠA组之间，尤其是ⅠB组和ⅠA组之间的MOD的差异有统计学意义，均数差分别为12．57、25．80、13．84和-1．96，P〈0．01。结论：p53蛋白空间构象的改变与p21^WAF1/CIP1蛋白定量表达的变化之间存在着质变与量变的关系。     

测定胃组织CD44+、CD71+细胞的临床意义

我们用流式细胞术 (FCM)检测 6 2例胃癌患者组织及其切缘组织、15例慢性萎缩性胃炎患者胃组织中CD4 4 、CD71 细胞含量 ,探讨其在胃癌中的变化。1.　材料和方法1.1　研究对象　 6 2例未经治疗、病理确诊的胃癌患者 ,手术切取胃癌组织标本及配对切缘组织。患者中男 4 1例 ,女