MassARRAY单核苷酸多态性MALDI-TOF质谱基因分型法检测未成熟冬虫夏草子座中多个冬虫夏草菌突变基因型

目的:检测未成熟冬虫夏草子座中同时存在的多种突变基因型冬虫夏草菌。方法:采用MassARRAY单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)质谱基因分型法,根据冬虫夏草菌基因内转录间隔区(ITS)序列的大量散在点突变,设计8个SNP延伸引物,利用质谱测定各个SNP位点的单核苷酸延伸反应,检测未成熟冬虫夏草子座中与GC偏倚基因型(gb#AB067721)冬虫夏草菌相关的突变基因型。结果:GC偏倚基因型和两个AT偏倚基因型同时存在于未成熟天然冬虫夏草子座中。SNP基因分型法还检测到另外至少两个未知序列的突变基因型。结论:已知的3个冬虫夏草菌基因型的共存提示在冬虫夏草的子座萌发阶段和成熟过程中可能存在DNA转换点突变;另外两个未知序列的基因型的存在提示冬虫夏草中可能存在DNA颠换点突变。     

大鼠激素性股骨头坏死脂代谢基因的作用通路

目的了解脂代谢有关基因表达谱和通路的改变与激素性股骨头坏死发病的关系。方法采用脂多糖(12S 10μg/kg)与甲泼尼龙[20 mg/(kg·d)]连续4 d肌肉注射制作大鼠股骨头坏死动物模型,取模型组(M)和对照组(C)大鼠股骨头进行组织形态计量学分析;测定血清总胆固醇(TC)含量;采用微阵列技术,测定和分析2组大鼠股骨头基因表达。结果 (1)股骨头组织形态学检测显示模型组大鼠发生激素性股骨头坏死,与对照组比较空骨陷窝率明显升高(P0.05);骨小梁体积、骨矿化速率、毛细血管面积均明显降低(P0.01)。(2)模型组大鼠血清总胆固醇含量明显高于正常组(P0.001)。(3)基因表达谱芯片检测结果显示,模型组有111个较对照组差异倍数大于2.0的表达基因。经MAS系统分析后发现有18个显著性变化的通路。(4)模型组大鼠6个与脂肪酸代谢通路(FAM)上调表达的关键基因、2个与脂肪酸在线粒体延长通路的基因(FAEM)、有3个与脂肪细胞分裂素信号通路上调表达的基因(ACK)。结论脂代谢有关基因的表达上调在大鼠激素性股骨头坏死发病机制中起重要作用。     

快速分析和鉴定肿瘤抗原研究

γδT细胞是近10多年来人们新认识的一种T细胞亚群,尽管其在抗原识别及其对多数肿瘤细胞的细胞毒作用中所独有的特性而受到越来越多学者的关注,但目前尚未发现可用于肿瘤免疫治疗靶点的γδT细胞所识别的肿瘤抗原。如何发现和快速分     

冬虫夏草的成熟伴随着冬虫夏草子座中多个基因突变型冬虫夏草菌表达的变化

目的:检测冬虫夏草成熟过程中冬虫夏草菌转换突变和颠换突变基因型在子座中表达的动态变化。方法:采用MassARRAY单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)质谱基因分型法,根据冬虫夏草菌基因内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列中大量散在的点突变,设计了8个SNP延伸引物,其中5个位于rDNA ITS1和ITS2段:067721-211,067721-240,067721-477,067721-531和067721-581,用于检验GC和AT偏倚基因型,但不区分两个AT偏倚基因型;另外3个延伸引物位于rDNA 5.8S段:067740-324,067740-328和067740-360,用于区分两个AT偏倚基因型。应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ioniza-tion-time of flight,MALDI-TOF)测定各个SNP位点的单核苷酸延伸反应,观察未成熟和成熟冬虫夏草子座中转换突变和颠换突变基因型表达的动态变化。结果:冬虫夏草子座rDNA的8个SNP位点的质谱图显示复杂的动态变化。067721-211位点的AT偏倚型等位基因的分子浓度明显高于GC偏倚型,但随着冬虫夏草的成熟,这个位点的AT型等位基因消失。多个SNP位点的质谱图中不仅显示转换突变的等位基因,颠换突变等位基因也有很高的检出率,有些甚至超过GC和AT偏倚基因型等位基因的峰高;而随着冬虫夏草的成熟,颠换突变等位基因的检出率和峰高趋于下降。在区分两个AT偏倚基因型的研究中,AB067744和AB067740两个基因型的等位基因同时存在于未成熟冬虫夏草子座中。随着冬虫夏草的成熟,AB067744基因型等位基因的峰高大幅度降低,而AB067740基因型等位基因的峰高大幅度升高。结论:在冬虫夏草子座中共存的至少5个冬虫夏草菌突变基因型的表达随着冬虫夏草的成熟呈现动态变化,这些突变基因型菌的存在和它们的动态变化对于冬虫夏草子座的萌发和成熟具有重要意义。     

乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究

目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制.     

白首乌甙对DEN诱发实验性肝癌大鼠肝细胞DNA含量和生长周期变化的影响

用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠发生实验性肝癌,用流式细胞仪分析自首乌甙对该模型大鼠肝细胞DNA含量和细胞生长周期的影响。实验结果表明治疗组大鼠与模型组比较,肝细胞内2倍体细胞明显增多,多倍体细胞明显减少;大鼠肝细胞处于G_0/G_1期的细胞显著增多,处于S期的细胞显著减少,说明白首乌甙可抑制肿瘤细胞DNA的合成,阻止肿瘤细胞分裂。     

利用miRNA芯片筛选大鼠颅脑创伤后皮层差异表达的miRNA

目的 筛选大鼠颅脑创伤后皮层差异表达的miRNA,为颅脑创伤治疗中的miRNA干预策略提供可供选择的目标miRNA.方法 利用miRNA芯片检测伤后6 h、24 h、48 h、72 h组各2例创伤大脑皮层组织与2例正常对照的差异表达基因.并随机挑选差异表达基因做PCR验证.结果 创伤后6 h组共有136个miRNA表达,其中2倍以上差异表达上调的13个,2倍以上差异表达下调的14个;24 h组共有118个miRNA表达,其中2倍以上差异表达上调的4个,2倍以上差异表达下调的23个;48 h组共有149个miRNA表达,其中2倍以上差异表达上调的16个,2倍以上差异表达下调的11个;72 h组共有203个miRNA表达,其中2倍以上差异表达上调的19个,2倍以上差异表达下调的5个.其中只有miR-21在4个伤后时间点上均高表达,分别为2.0215、2.0401、2.0702、2.7910.定量PCR验证结果提示芯片结果可信.结论 创伤大脑皮层的差异表达miRNA在以往文献中鲜见报道,对其干预有望成为颅脑创伤基因治疗的新靶向.     

菟丝子金丝桃苷体内外对小鼠免疫细胞功能的影响

目的：应用菟丝子有效成分金丝桃苷对小鼠免疫功能的影响进行了体内外研究。方法：一定浓度的菟丝子金丝桃苷经体内和体外作用一定时间后,分别测定小鼠脾T、B淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的功能变化。结果：金丝桃苷体内剂量在300mg/kg和150mg/kg时对小鼠胸腺指数及脾T、B淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞吞噬功能具有明显的抑制作用。而浓度在50mg/kg时对小鼠脾脏T、B淋巴细胞的增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能具有明显的增强作用。另外,金丝桃苷体外剂量在100－6.25μg/ml时能显著增强脾T、B淋巴细胞的增殖和促进T淋巴细胞产生IL－2的能力,同时也能增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能和释放NO的能力。结论：一定浓度的菟丝子金丝桃苷在体内外具有增强免疫功能的作用。