融水小型猪的实验动物化系列研究概述

融水小型猪的种源来自广西融水县,2012年被引到广东繁育并测定了基础数据,包括种质特性、繁殖性能、生长曲线、血液学指标、血生化指标、脏器系数、染色体分析。参照国家和地方有关实验动物标准,初步建立了融水小型猪微生物与寄生虫、环境与设施、饲料、病理学、遗传学等质量控制标准。融水小型猪能适应当地气候,繁殖良好,自然受孕率为88.3%,妊娠期平均112 d,初产平均胎产仔6.1头,经产平均产仔7.9头。融水小型猪体型小,雌雄成年体重(6月龄)分别为17.21±5.20 kg和16.35±5.23 kg,性情温顺,线粒体DNA分析表明融水小型猪比兰屿猪更为古老。通过标准化的饲养管理与质量控制,具有培育成实验用小型猪的基本条件。     

精子细胞输精管及附睾管内转染法建立转基因小鼠

目前，生产转基因动物主要的方法仍是受精卵显微注射法，所需设备复杂，技术难度大，成功率低。为此，人们都在寻找一种新的方法。利用精子携带外源DNA进入卵母细胞的精子载体法是设想之一。九十年代初，Mare和Rottmann等分别报导了电击法和脂质体转染法让精子在体外携带上外源DNA，再行体外受精的方法，引起了学者们的广泛关注，但其结果不稳定，阳性率极低。我们采用脂质体包裹外源DNA，直接注入输精管内，数天后与雌鼠交配的方法，得到了较为满意的结果，现简报如下。1材料和方法将构建好的WAP－t－PA质粒与脂质体混合制备成转染…     

电穿孔导入法在外源基因转染家兔精子的作用研究

<正> 目前建立转基因动物最常用的方法仍然是经典的受精卵显微注射法.但这一方法存在诸多的不足之外:所需的仪器设备价格昂贵;技术要求高;成功率低.电穿孔导入法,是通过高压电场使细胞膜通透性发生暂时性的可逆变化,从而使DNA分子进入细胞内的一种物理方法.目前已有一些穿孔导入法促使外源基因转染精子的报道,但由于各处实验室所使用的电击仪器不同,电击缓冲液及电击条件也不相同,因此,各实验结果的报道并不一致.我们用假阴道法采集家兔精子,经电击缓冲液洗涤3次,调整精子浓度至10~6个/ml.电击悬液总体积100ml,加入环状重组质粒pV-WAP-tPA(浓度20μg/ml).使用BAERON600型基因转移仪,设电击条件:周期10;脉冲数1000;脉冲宽度100;距离2.0mm;电压2000,4000,6000;脉冲时间500,1000,1500ms.另设电击悬液中不加质粒作     

小鼠精原细胞的分离和纯化

目的　探讨小鼠精原细胞的分离纯化。　方法　用组合酶消化法制备 7～ 8d小鼠的生殖细胞悬液 ;用Percoll不连续密度梯度法分离精原细胞。　结果　所获细胞悬液内活细胞、死细胞及细胞团的百分比分别为90 .0 8%、9.92 %及 8.91% ;平均每个睾丸可获得 4.136× 10 5 个细胞 ;精原细胞主要分布于位于 2 7%～ 35 %间的Percoll梯度中 ,其超微结构与 7～ 8d小鼠睾丸切片内精原细胞的超微结构一致 ,经纯化后其纯度达 6 8.76 %。　结论　用组合酶消化、Percoll不连续密度梯度法分离的 7～ 8d小鼠的精原细胞能满足体外培养的需要     

转基因兔与克隆兔高效胚胎移植体系的建立

目的建立高效的转基因兔和克隆兔的胚胎移植实验技术平台。方法通过外科手术移植的方法将受精胚胎、转基因胚胎和体细胞核移植胚胎分别移植到同步发情或异步发情的受体兔输卵管。结果移植受精胚胎、转基因胚胎和体细胞核移植胚胎的受体兔怀孕率分别为100％、66．67％、36.36％,产仔数分别为19、24及17只,仔兔的成活率分别为90.48％、92．31％、17．65％。出生仔兔与移植胚胎数的比率分别为43．75％、21．31％、8．54％。结论成功建立了高效的转基因兔和克隆兔的胚胎移植的实验技术平台。     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。     

脂质体介导外源基因体外转染精子的研究

目的 为探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的可行性。 方法 我们从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子，与阳离子脂质体包裹的DNA混合孵育之后将其注入超排卵小鼠的阴道内，48 h后收集II细胞期胚胎细胞。结果 (1) 精子可转染上外源DNA，转染率达53%；(2) 转染有外源DNA的精子可使II细胞期胚胎携带上外源基因，携带率为11.5%。结论 小鼠输精管及附睾管内的精子可被脂质体包裹的外源DNA转染并可作为载体将此外源DNA带入早期胚胎。     

胚胎干细胞分离培养的影响因素

ＥＳ细胞体外生长的环境要求极为苛刻，原则上应满足两个条件：①促进细胞的分裂增殖；②抑制细胞的分化。前者受到基本培养基、添加剂、血清和生长因子的影响，后者则涉及到动物早期胚胎的胚龄和饲养层细胞种类的选择、条件培养基和生长因子的运用以及其它类型细胞（如滋胚层细胞）的影响。不同动物胚胎在体内发育有不同特点，对体外生长的环境要求不同，针对不同动物，应采取相应的策略，才能建立起真正的ＥＳ细胞。     

异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立

随着临床上器官衰竭及功能缺陷等疾病的日益增多,器官移植一直是医生及科学家们努力尝试解决的问题,包括肝脏、肾脏、心脏等重要器官的移植和重建,因此合适的移植供体就显得尤为重要。由于人与人之间移植供体资源匮乏,且找到同型合适匹配的脏器来源更为稀缺.     

西藏小型猪胚胎成纤维细胞的分离培养及性别鉴定

目的探索和建立西藏小型猪胚胎成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法。方法取35 d的西藏小型猪胚胎分离胚胎成纤维细胞,进行体外原代培养及传代培养,观察细胞成纤维细胞的形态和生长状况。根据猪Y染色体上性别决定基因SRY设计引物进行性别鉴定,同时以β珠蛋白作为内参基因,建立PCR反应体系鉴别胚胎的性别。结果西藏小型猪胚胎成纤维体外分离后,呈贴壁生长,快速增殖。PCR性别鉴定结果表明雄性胚胎细胞可扩增出一特异性SRY基因条带,而雌性则没有。该法可快速鉴定胚胎的性别,可用于体细胞克隆动物早期性别鉴定。结论研究结果表明利用胶原酶消化法所获得的西藏小型猪胚胎成纤维细胞可在体外稳定培养并传代,利用PCR鉴定猪胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于克隆猪研究中体细胞系的早期性别鉴定。