人源H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性和致病性研究

目的观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑特性,对比研究不同空斑类型H5N1病毒致病性和复制能力差异。方法将不同稀释度的H5N1亚型禽流感病毒株分别接种于MDCK单层细胞,加盖营养琼脂,合适时间染色,观察不同H5N1亚型禽流感病毒株空斑形成特点,按照DullbeccoR的方法计算病毒PFU数;根据空斑大小进行挑选、纯化、筛选不同类型空斑病毒,测定这些病毒对Balb/c小鼠致病性差异和在MDCK细胞上复制差异。结果野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,空斑大小、形状差异明显:A/Vietnam/1194/2004(H5N1)以大圆形斑为主,夹杂少量小点状斑。A/Beijing/01/03(H5N1)大多数为中等大小空斑,并有少数针尖状斑。野生A/Vietnam/1194/2004经过分离纯化后,得到的两种空斑类型病毒在致病性和复制能力存在明显差异。结论野生的人源H5N1禽流感病毒株在空斑形成上都存在不同程度的不均一性,从野生病毒株中分离、纯化的大小斑病毒在致病性和复制能力上存在明显差异。     

钙调神经磷酸酶对前B淋巴细胞及其转化的白血病细胞凋亡影响的研究

本研究比较钙调神经磷酸酶（calcineurin,PP2B,PP3）在小鼠前B淋巴细胞系（S9）及其转化的白血病细胞系（S4C2）中的差异表达,并探讨其参与白血病细胞凋亡的可能机制.用实时定量PCR技术检测H2AX磷酸化酶ATM、ATR、DNA-PKs、JNK1、P38和γ-H2AX磷酸酶PP1、PP2A、calcineurin、PP4、PP6、PP5 γ-PP2c、WIP-1在S9细胞和S4C2细胞之间的表达差异.用CCK-8法和流式细胞术检测伊马替尼（IM）和环孢霉素A（CsA）对细胞的毒性作用和凋亡的影响.利用Western blot技术检测药物对S9细胞和S4C2细胞凋亡的影响.结果发现,钙调神经磷酸酶基因在白血病细胞S4C2中的表达约为S9细胞的3.5倍,而其余基因的表达在两种细胞间无明显差异.IM和CsA对S4C2细胞的促凋亡作用明显强于S9细胞,同时两种药物对S4C2细胞毒性作用高于对S9细胞的毒性作用.钙调神经磷酸酶蛋白在S4C2细胞中的表达高于S9细胞.CsA特异性抑制钙调神经磷酸酶活性后,DNA损伤标记物γ-H2AX在S9细胞的表达明显低于S4C2细胞,而伊马替尼对其表达的影响在两细胞系之间无明显差异,联合应用两种药物时γ-H2AX在S9细胞的表达也低于S4C2细胞.结论：钙调神经磷酸酶在B淋巴细胞白血病细胞中发挥一定的抗凋亡作用,环孢素A抑制钙调神经磷酸酶活性促进了白血病细胞的凋亡.     

一种新型自体NK细胞扩增培养方法的建立和初步临床应用

目的应用一种新型的自体NK细胞扩增培养方法,并进行初步的临床试验。方法采集患者静脉血30ml,用Ficoll法分离外周血单核细胞,用NKGM培养体系培养两周,收集细胞后回输患者。实验全程在GMP实验室进行,并做好质量控制。结果通过14 d的细胞培养,淋巴细胞总数扩增了约200～300倍,其中NK细胞和CD8+T细胞均扩增了约500倍,最终NK细胞和CD8+T细胞的比例约为36%～53%、38%～51%。对1例处于化疗后部分缓解的肺癌且伴多发转移的患者进行两个疗程的细胞治疗,患者血清肿瘤标志物糖类抗原(CA)19-9呈进行性降低。而且在NK细胞输注后的2～6周,仍可检测出患者外周血淋巴细胞中NK细胞的比例高达约31%。结论 NKGM培养体系可通过两周的培养使外周血单核细胞扩增约250倍,而且NK细胞的纯度可高达53%。同时,该细胞疗法具有很好的安全性和便捷性,应用于肿瘤患者可通过维持外周血NK细胞的高比例而发挥积极的临床疗效。     

浅谈医院中心实验室管理与生物安全防范

医院中心实验室是集中了医院资源配置一系列软硬件条件,为医院内外科技人员提供开放式、服务式的科研技术平台。从实验室科研条件建设、开放性服务、实验室日常管理、实验室人才队伍建设、学术交流与合作、适当服务临床等六个方面论述了加强中心实验室的管理,并从依据法规办事,有备无患、控制传染源头、切断传播途径、提高实验人员的生物安全意识等四个方面阐述了实验室生物安全防范工作的具体措施。     

5种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立

目的建立同时检测1~4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒等5种虫媒病毒的悬浮芯片检测方法。方法根据GenBank发表的上述病毒的序列,通过生物信息学分析和参考相关文献,在黄病毒属高度保守的NS5区设计属通用引物和种特异检测探针。将探针共价交联到不同的Luminex色标微球上,利用属通用引物进行RT-PCR扩增,与混合微球杂交,最后利用Luminex200仪器分析荧光强度值。结果将平均荧光强度的判定阈值定为背景对照的两倍可以对这5种共8型病毒进行有效鉴定。通过多批次的实验,均能准确鉴定出上述5种病毒,没有出现交叉反应,且批次间的平均荧光值偏离不大,变异系数(CV)均小于8%,表明本方法的特异性和稳定性均较好。在空斑滴定病毒的基础上,对本方法的检测敏感性进行了验证,结果表明对乙脑和黄热病病毒的检测敏感性可达到1.4个PFU,对西尼罗病毒可达14个PFU。进而将本方法用于检测55份临床标本和传代标本,其检测结果和种特异RT-PCR方法相比,具有很高的一致性,而且其在混合样本的快速检测中具有显著的优势。结论通过设计合适的引物和探针,成功建立了可同时检测和分型5种虫媒病毒的悬浮芯片方法,为疾病的诊断和预防以及流行病学调查提供了新的手段。     

c-Jun氨基末端激酶1和2在角质形成细胞系Hacat细胞中的作用

目的研究同工酶JNK1和JNK2在Hacat细胞中的功能差异,探讨其在皮肤肿瘤治疗中的潜在价值。方法分别将JNK1和JNK2的siRNA导入Hacat细胞,通过Western Blot技术在蛋白质水平对其敲低效果进行鉴定。CCK-8法检测细胞增殖曲线,流式细胞术检测细胞周期,不同剂量的Taxol进行凋亡诱导实验,分析正常Hacat细胞与JNK1/2敲低细胞的区别。结果细胞增殖实验表明,JNK1或JNK2敲低均可导致增殖变缓,JNK1敲低效果更明显。细胞周期结果显示,JNK1敲低可导致S期细胞减少,G2/M期升高。Taxol凋亡诱导实验表明,JNK2敲低组凋亡显著增加,而对照组和JNK1敲低组凋亡变化不明显。结论在细胞增殖方面,JNK1作用强于JNK2;而在抗凋亡方面,JNK2作用强于JNK1。     

中汇川黄液治疗高脂血症的临床研究

随着生活水平的提高，高脂血症的发生率有明显增加的趋势[1]。目前治疗高脂血症的药物虽然很多，但各有优缺点。药理实验表明：中汇川黄液（中国中医研究院汇源制药公司生产）有较好的降脂作用和补益气血、活血化瘀等功能，为了验证其临床疗效，我们进行了下列研究，现报道如下。1资料与方法1．1一般资料本组32例，其中男19例，女13例；年龄28～74岁，平均为45．5岁；有冠心病者7例，有高血压病者9例，有合并糖尿病者3例，无明显症状者17例；其中病程最长者20年，最短者5个月。所有病例均为自我院门诊或住院患者，诊断均以血脂检测结果为依…     

移位髋臼骨折手术治疗临床体会

目的:探讨移位髋臼骨折的手术治疗方法和效果。方法:根据不同类型对47例髋臼移位骨折采用Kocher-Lange-nbeck(K-L)入路,髂腹股沟入路,前后联合入路进行切开复位,骨盒重建钢板和螺钉内固定。结果:术中无血管神经损伤,术后无切口感染,47例均获随访。根据Merled‘Aubigue临床评定标准,优23例,良16例,可7例,差1例,优良率82.9%。结论:对有移位的髋臼骨折采用手术切开复位内固定,效果良好,正确判断骨折类型,选择最佳手术时机和手术入路,术中准确复位和坚强内固定是提高移位髋臼骨折疗效的关键。     

白血病细胞系K562可以诱导外周血NK细胞凋亡

摘要：目的探讨红白血病细胞系K562对自然杀伤细胞（NK cells）诱导凋亡的作用。方法利用MACS免疫磁珠阴性分选纯化
健康志愿者外周血NK细胞,用重组人白介素-2（rhIL-2）和干细胞培养液培养、观察NK细胞。把NK细胞与人红白血病细胞系
K562按不同效靶比例和作用时间混合培养,用PE-AnnexinV/7-AAD凋亡试剂盒检测这两种细胞各自的凋亡情況。结果免疫
磁珠分选后NK细胞纯度为（93.99±4.22）%;K562细胞诱导NK细胞凋亡作用时,在相同效靶比情况下,随着共培养时间的延长,
NK细胞凋亡率显著增高;在相同培养时间的情况下,随着效靶比降低,NK细胞凋亡率逐渐升高,杀伤活性逐渐减低。结论红
白血病细胞系K562可以诱导活化的NK细胞凋亡,这有可能是肿瘤细胞发生免疫逃逸的机制之一。
     

H2AX磷酸化抑制肺癌细胞发生上皮-间质转化的作用机制

背景与目的：上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）是肿瘤细胞发生转移的关键生物学过程,阻碍EMT将抑制肿瘤转移,因此阐明EMT的分子机制具有重要意义。抑癌蛋白H2AX调控肿瘤细胞凋亡相关基因表达,进而产生抗肿瘤作用。揭示H2AX与EMT的关系,探讨H2AX调控肺癌细胞EMT可能的作用机制。方法：利用5%胎牛血清诱导肺癌A549稳定株细胞（包括H2AX基因沉默、H2AX过表达和H2AX磷酸化位点突变）产生EMT。采用蛋白质印迹法（Western blot）和实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）检测肿瘤细胞EMT标志性分子E-cadherin和vimentin的表达、以及其他EMT相关蛋白血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2）等分子的表达。采用transwell实验分析肺癌A549细胞的迁移和侵袭能力。结果：基因沉默肺癌A549细胞H2AX导致E-cadherin蛋白和mRNA水平下调以及vimentin蛋白和mRNA水平的上调,并增强A549细胞的迁移和侵袭能力。肺癌A549细胞过表达H2AX则上调E-cadherin蛋白和mRNA、下调vimentin蛋白和mRNA,抑制A549细胞的迁移和侵袭;H2AX磷酸化位点突变则部分消除H2AX对E-cadherin上调和vimentin的下调作用以及H2AX对A549细胞EMT的抑制作用;肺癌A549细胞中H2AX基因沉默则刺激VEGFR-2表达,过表达H2AX则抑制VEGFR-2表达;H2AX磷酸化位点突变则消除H2AX对VEGFR-2表达的抑制作用;基因沉默A549细胞中VEGFR-2则抑制EMT作用;H2AX基因沉默刺激肺癌A549细胞EMT相关因子Slug和β-catenin的表达,过表达H2AX抑制Slug和β-catenin表达;H2AX磷酸化位点突变后则消除H2AX对Slug和β-catenin表达的抑制作用。结论：γH2AX通过下调VEGFR-2以及Slug和β-catenin表达进而抑制肺癌A549的EMT过程。