中药地龙中参环毛蚓环介导等温扩增快速检测方法

[目的]建立中药材地龙中参环毛蚓的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,实现对参环毛蚓的快速检测。[方法]采集不同产地地龙,提取总DNA后将所提取的总DNA进行线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COI)基因片段扩增、测序、比对,判断各产地地龙物种。用设计的LAMP引物组进行地龙LAMP实验,反应结束后向扩增产物中加入核酸染料SYBR GreenⅠ,分别在自然光、紫外光下直接通过肉眼来观察颜色变化及利用琼脂糖凝胶电泳来检测其引物的特异性。[结果]利用新设计的LAMP引物对参环毛蚓实现了特异性扩增,且检出限达40 fg/μL,具有极高的灵敏度。[结论]利用LAMP技术可实现参环毛蚓的现场快速检测。     

药用动物乌梢蛇线粒体基因组全序列分析

[目的]获取药用动物乌梢蛇线粒体基因组全序列。[方法]采用Ion Torrent PGM技术,对乌梢蛇全基因组DNA进行提取测序,采用MIRA方法从头组装方法和近缘种mapping方法进行组装拼接,应用MITOS等方法进行注释。[结果]获得17 162 bp乌梢蛇线粒体基因组全序列。其共编码22个tRNA,13个蛋白编码基因,2个rRNA(16S rRNA、12S rRNA)并有1个轻链(L链)复制起始区。[结论]获取乌梢蛇线粒体基因组全序列,并可用于该药用动物的资源调查与保护研究。     

基于DNA条形码区域的中药地鳖隐存物种多样性发现研究

[目的]基于DNA条形码COI数据,发现地鳖(土鳖虫主要基原)内部可能的隐存多样性。[方法]对8批33个地鳖个体的线粒体COI片段进行PCR扩增及序列测定。分析COI序列单倍型,分析变异位点,运用邻接法、最大简约法分别构建分子系统发育树,结合种群(批次)内及临时种间的遗传距离发现隐存多样性。[结果]根据系统发育结果区分临时种EsPS1及EsPS2。分析得到COI基因的物种间阈值SST为5.33%。临时种EsPS1与EsPS2间的最小遗传距离为12.00%,显著大于物种间阈值SST。[结论]地鳖内部存在隐存物种多样性。     

中成药大黄蛰虫丸的宏条形码基原鉴定

[目的]探索应用宏条形码方法进行复方中成药基原鉴定分析的可行性。[方法]磁珠法提取中药大黄蛰虫丸DNA,以16S、trnL及Mini-barcode为靶标进行荧光定量PCR。产物经克隆测序拼接后,经BLASTn比对,用MEGAN软件进行分类单元解析,对虻虫来源序列应用MEGA软件进行遗传分析。[结果]从23条单克隆测序结果中解析到蛴螬、虻虫、甘草及桃仁或苦杏仁等中药成分,对虻虫6条序列分析,显示其源于3组遗传差异较显著的个体。[结论]宏条形码技术可用于中成药成分的鉴定,可作为中成药质量评价的潜在工具。     

基于网络药理学分析宣肺败毒方治疗SARS、MERS和COVID-19的作用机制

目的 探讨宣肺败毒方对冠状病毒感染治疗作用的有效成分、作用靶点、信号通路等,从而阐释其作用机制。方法 利用Cytoscape构建了宣肺败毒方的药物–性–味–归经网络。采用TCMSP数据库、SwissADME数据库和Swiss Target Prediction数据库筛选宣肺败毒方的有效成分和相关靶点,通过GeneCards数据库和CTD数据库收集严重急性呼吸道疾病（SARS）、2012年的中东呼吸综合征（MERS）和新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的疾病靶点,将药物靶点和疾病靶点取交集,利用Cytoscape软件构建网络;运用String数据库,对潜在靶点进行蛋白相互作用（PPI）网络模型构建;通过Metascape数据库对潜在靶点进行GO和KEGG富集分析,并且用Cytoscape构建网络。结果 宣肺败毒方中有10种药材与肺经有关。从中筛选出167个活性成分和242个潜在作用靶点,核心药物为甘草、麻黄、青蒿、马鞭草、虎杖,核心成分为槲皮素、豆甾醇、山柰酚、木犀草素、异鼠李素等,核心靶点为AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF等,可能的作用机制与PI3K-Akt signaling pathway、HIF-1 signaling pathway和TNF signaling pathway等多个信号通路有关。结论 通过网络药理学探讨了宣肺败毒方对SARS、MERS和COVID-19的潜在共同作用机制,体现了中药多成分、多靶点、多途径的作用特点。     

基于环介导等温扩增技术快速鉴定宽体金线蛭

[目的] 建立中药材宽体金线蛭的环介导等温扩增（LAMP）检测技术，实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速检测。[方法] 针对宽体金线蛭线粒体细胞色素氧化酶I（COI）的基因序列设计LAMP引物。在64℃恒温条件下，用设计的LAMP引物组对水蛭进行LAMP扩增。[结果] LAMP反应结束后，宽体金线蛭均扩增出梯状条带，对照组无条带产生。加入0.2 μL荧光染料10 000×SYBR Green Ⅰ后，宽体金线蛭反应液在自然光下呈绿色（阳性），对照组呈橙色（阴性）。将加入了0.2μL 10 000×SYBR Green Ⅰ的扩增产物置于紫外灯下观察，结果宽体金线蛭在紫外光下呈绿色荧光（阳性），对照组无绿色荧光产生（阴性）。[结论] 利用LAMP技术可实现宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别，为水蛭中药材的现场鉴别提供技术支撑。     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点，设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物，建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法，实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列，寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点，设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带，混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色，宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光，混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品，为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

基于活性筛选和靶标网络预测的蒲黄和赤芍选择性抑制血小板聚集作用

目的:探讨常用活血化瘀中药抗血小板活性的激动剂选择性及可能的作用通路。方法:通过体外高通量血小板聚集实验系统评价24种常用活血化瘀中药醇提取物抗二磷酸腺苷(ADP)和凝血酶诱导的血小板聚集活性;通过Ingenuity Pathway Analysis(IPA)预测代表性药物蒲黄与赤芍已知单体成分的作用靶点,并加以验证。结果:蒲黄抗ADP,凝血酶诱导血小板聚集的半数抑制浓度(IC50)分别为55.27,300.60 mg·L~(-1);赤芍抗ADP,凝血酶诱导血小板聚集的IC50分别为336.20,101.60 mg·L~(-1)。IPA预测提示,蒲黄与赤芍有可能通过调节Ca2+,环磷酸腺苷(c AMP)和一氧化氮(NO)水平抑制血小板聚集。实验发现,蒲黄可明显抑制ADP对血小板内Ca2+的升高(P0.05,P0.01);赤芍可显著提高凝血酶导致的血小板内NO浓度降低(P0.01);蒲黄、赤芍均不能逆转ADP,凝血酶引起的血小板内c AMP浓度降低。结论:蒲黄和赤芍醇提物分别具有选择性抗ADP和凝血酶诱导的大鼠血小板聚集活性。与IPA预测相符,蒲黄可降低血小板内钙离子水平,赤芍可提高血小板内NO浓度,可能分别激活嘌呤能P2Y1受体下游的Gq亚基/磷脂酶C(PLC)/三磷酸肌醇(IP3)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(e NOS)通路抑制血小板聚集。     

华蟾素抗肿瘤研究进展

华蟾素是我国传统中药材中华大蟾蜍干皮的提取物,其主要成分为蟾毒内酯类、生物碱类、多肽类、胆固醇类等。随着对华蟾素药理作用的深入研究,已证实华蟾素在抗炎、抗病毒、抗肿瘤、消肿止痛等方面具有重要的应用价值。近年来,华蟾素的抗肿瘤活性逐渐被国内外学者重视。分子药理学研究表明,华蟾素主要通过增强机体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞多药耐药性以及抑制肿瘤血管生成等多种途径发挥抗肿瘤作用。华蟾素诱导细胞凋亡的机制涉及广泛,包括死亡受体介导的外源性信号通路和线粒体参与的内源性信号通路,有多种酶或蛋白参与了华蟾素诱导细胞凋亡的过程。临床研究表明,华蟾素作为临床上常用的抗肿瘤中药制剂,具有低毒、副作用少、抗癌谱广等特点,广泛应用于肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胆囊癌、非霍奇金淋巴瘤等发病率较高的肿瘤的治疗,无论单独应用还是与其他药物联合应用均表现出良好疗效,单独应用时,对中晚期肿瘤患者具有较好疗效,联合应用时,可以提高疗效,减少不良反应。为了促进华蟾素抗肿瘤活性的研究,扩大其应用前景,本文通过对华蟾素近年来相关文献的整理归纳,对其抗肿瘤机制的研究进展及其在临床上的应用做一综述,以供实验研究及临床参考。     

哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列分析

[目的]获取哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列。[方法]应用差速离心以及滚环扩增的方法得到纯度较高的线粒体DNA,采用Illumina HiSeq X Ten技术对扩增得到的哈氏蜈蚣线粒体DNA进行测序,采用从头组装和mapping近缘种的方法拼接组装线粒体基因组,应用MITOS在线注释及与近缘种进行本地注释等方法注释线粒体基因组。[结果]获得14 538 bp哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列。其共有20个tRNA及13个蛋白基因,2个rRNA(16S rRNA、12S rRNA)。[结论]获取哈氏蜈蚣线粒体基因组全序列,并可用于药用蜈蚣的资源调查与保护研究。