褪黑素延缓糖尿病大鼠肾脏细胞衰老的机制研究

目的 观察褪黑素(MLT)对糖尿病肾病(DN)大鼠的影响,探究MLT延缓大鼠DN进程的作用机制.方法 SD雄性大鼠15只随机分成正常组、模型组、MLT组,每组各5只.模型组及MLT组采用腹腔注射法给予链脲佐菌素(STZ)55 mg/kg,建立DN大鼠模型.成功建立模型后,MLT组采用腹腔注射给予MLT 10 mg/(kg·d),正常组与模型组给予等体积生理盐水.连续给药16周后,取大鼠腹主动脉血及肾脏组织,检测血清中尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR);Masson染色观察肾脏组织形态学变化;β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)检测肾脏细胞衰老变化;采用Western blot法检测肾脏组织中自噬标志物(p62、LC3B)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)及细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)抑制因子(p16、p53和p21)的表达水平.结果 与正常组比较,模型组血清中BUN、SCR水平升高,肾间质纤维化明显,肾脏组织自噬水平降低,MLCK、p16、p53、p21表达水平均升高.给予MLT后,与模型组比较,MLT组血清中BUN、SCR水平降低,肾脏组织衰老延缓,病理损伤明显减轻,肾脏组织自噬水平也得到改善,MLCK、p16、p53、p21表达水平均降低.结论 MLT可以通过增强自噬、延缓衰老进而改善DN大鼠的DN进程.     

褪黑素通过 ERK/MAPK 通路调控 AS 兔动脉内皮细胞 MLCK 表达

 目的 探讨褪黑素（ melatonin ， MLT ）是否可通过信号调节激酶 / 丝裂原活化蛋白激酶（ ERK/MAPK ）通路调控动脉粥样硬化（ atherosclerosis ， AS ）模型兔动脉内皮细胞肌球蛋白轻链激酶（ myosin light chain kinase ， MLCK ）的表达。 方法 复制兔 AS 模型，分析血清中相关脂质成分的动态变化；γ -³²P-ATP 掺入法测定模型兔主动脉的 MLCK 活性；动脉经冰冻切片，免疫组化检测动脉内膜 MLCK 的表达，伊红（ HE ）染色观察动脉壁的形态结构； Western blot 检测 AS 兔动脉组织 MLCK 的表达和 ERK 磷酸化水平。 结果 AS 兔模型复制成功，实验兔在高胆固醇（ cholesterol ， Cho ）饮食 4 ， 8 ， 12 周后，与正常对照相比，血清中相关生化指标有逐渐增加趋势（ <> P <0.05 ）；γ -³²P-ATP 掺入法显示动脉组织中 MLCK 的活性呈逐渐增强趋势（ <> P <0.05 ）， Western blot 和免疫组化则显示动脉内皮细胞 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平亦呈逐渐增强趋势， HE 染色显示主动脉内膜逐渐增厚，细胞间隙逐渐增大；而加喂 MLT 后，动脉组织 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平及 MLCK 的活性和主动脉内膜通透性均有所下降，而泡沫细胞形成量逐渐增多，至高 Cho 饮食 12 周时则形成了明显的 AS 斑块，加喂 MLT 后，主动脉内膜病变则有一定程度减轻。 结论 MLT 可能通过 ERK/MAPK 通路下调模型兔动脉内皮细胞 MLCK 活性而减轻 AS 斑块的病变程度。     

人非肌肉肌球蛋白轻链激酶N端表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建人非肌肉肌球蛋白轻链激酶(hnmMLCK)N端表达载体及其体外表达与表达产物的纯化。方法：用PCR方法扩增hnmMLCK的N端cDNA ,插入质粒pBKcmv中的构建成表达载体，转化入大肠杆菌XL1-blue，经IPTG诱导表达，表达产物用电洗脱的方法初步纯化。结果：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为hnmMLCK重组质粒，SDS－PAGE证实获得分子量为21ku的融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21％。结论：成功构建了重组hnmMLCK表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究及临床应用奠定了良好基础。     

原核细胞阳性克隆的筛选

基因重组的连接反应物通过转化产生大量转化菌 ,只有通过高敏感和高特异的筛选方法才能挑选和鉴定出含有正确目的基因的重组体。此类方法的基本原理基于 :① 196 7年 ,Ullmann等发现大肠杆菌带有完整的近操纵基因区段 β D半乳糖甘酶阴性的突变体和LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体之间互补 ,实现对 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D半乳糖(X gal)分解显色形成蓝色菌落 ;② 1975年 ,Grun stein和Hogness介绍一种在硝酸纤维素膜上原位裂解细菌菌落并释放DNA非共价结合于滤膜的方法 ,结合于滤膜的DNA可与相应的放射性标记的核酸探针进行杂…     

限制性内切酶酶切及限制性内切酶酶切图谱分析

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类能够识别DNA的特异序列并在识别位点剪切双链DNA的核酸内切酶。主要存在于原核生物中，大多数来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制一修饰体系，限制外源DNA、保护内源DNA。1970年Smith等分离到第一种限     

质粒的制备

随着人类基因组计划的顺利进行 ,一个更为广阔且具活力和应用前景的研究领域人类基因组后计划已形成 ,并吸引全世界顶尖科学家和实验室参与。人类基因组后计划的研究内容主要涉及功能基因的分离、鉴定 ,其编码蛋白质的生物学功能及其可应用研究。本领域所采用的研究方法主要包括分子生物学、蛋白质组学和功能蛋白质学等实验方法。其中 ,分子生物学常用实验方法在研究中使用最广 ,可变性最大 ,且可选择最多。为提高我校广大科学研究者对分子生物学技术和实验方法有一较全面的了解和知晓本校可用的资源 ,特邀请本校分子生物学中心试验室根据其研究工作撰写有关分子生物学常用实验方法的介绍 ,并陆续在本刊上发表 ,供大家参考     

临床医学专业留学生生物化学与分子生物学教学质量评价体系建设

安徽医科大学于2010年开始招收来华学习的全英文教学本科临床医学专业留学生,随着对外交流的进一步加强,留学生的招生数量和招生规模也有所增加。该校高等教育中,留学生教育已成为重要组成部分。在医学专业留学生必修的课程中,生物化学与分子生物学是一门非常重要的专业基础课程,如何提高留学生对生物化学与分子生物学课程的学习兴趣并提高学习效果,是该课程教学中要研究的重要方向。根据历年教学中总结的经验和留学生本身的特点,该教研室提出在生物化学与分子生物学教学中建立一套新的适合留学生教学的教学质量评价体系,以提高留学生对该课程学习的兴趣、减轻学习压力,最终达到提高该课程学习效果的目的。     

VitE对动脉粥样硬化模型兔肝脏肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响

目的　探讨维生素E(VitE)对动脉粥样硬化模型兔肝脏MLCK活性及表达的影响。方法　复制兔动脉粥样硬化模型 ,用γ 3 2 P参入法检测肝脏MLCK活性 ,免疫荧光法检测肝组织MLCK的表达。结果　动脉粥样硬化兔模型建立成功 ,在喂胆固醇 4wk及 12wk的动物组 ,肝脏MLCK活性[分别为 (1884 8 7± 74 34 3)、(18818 3± 346 9 9)cpm·mg-1protein]与正常对照比较 [(6 6 77 5± 10 9 6 0 )cpm·mg-1pro tein]升高 (P <0 0 5 ) ;但在喂胆固醇同时添加VitE后 ,肝脏MLCK活性 [(10 898 8± 2 0 4 1 2 )cpm·mg-1protein]与正常对照组比较升高不明显 (P >0 0 5 )。荧光显微镜下观察显示 ,兔肝在喂食胆固醇膳食 4wk后MLCK的表达有所增强 ,12wk后显著增强 ,12wk组的膳食中同时加VitE后 ,MLCK表达有所下降。结论　在动脉粥样硬化过程中 ,肝脏病变可能与MLCK活性增强有关 ,VitE可能是降低肝脏MLCK活性的因素 ,同时防止肝细胞的损伤     

胰岛素对糖尿病模型大鼠肾脏肌球蛋白轻链激酶表达的影响

已知糖尿病早期肾小球滤过率(GFR)升高,并与糖尿病肾病的发展有关[1,2].肾小动脉血管平滑肌的收缩改变了肾血流动力学是引起GFR升高的原因之一.探索糖尿病肾血管平滑肌收缩的调控因素可为进一步阐明糖尿病发生发展机制打下良好的基础.肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达增加和活性升高是血管平滑肌收缩的启动因素之一[3].糖尿病个体是否存在MLCK表达的变化尚未见报道.本研究在复制大鼠糖尿病模型的基础上,观察胰岛素对糖尿病大鼠肾MLCK表达的影响.