建立高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系的研究

目的:建立一个组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系.方法:(1)采用重组DNA技术将小鼠Retn基因的全长cDNA克隆到质粒pcDNA3的CMV启动子下面而获得一个能在真核细胞内组成性表达小鼠Resistin蛋白的表达载体pcDNA3-mRetn.(2)用电穿孔转染和G418筛选等方法建立能组成性地高表达小鼠Retn基因的3T3-L1细胞系.(3)诱导细胞分化为脂肪细胞,并用实时荧光RT-PCR法分析这些脂肪细胞内Retn基因mRNA的水平.结果:构建了一个能在真核细胞内表达小鼠Retn基因的表达载体;建立了一个携带有pcDNA3-mRetn载体并组成性地高表达小鼠Retn基因的细胞系.结论:成功地建立了一个组成性地高表达小鼠Retn基因细胞系,为进一步研究Retn基因的功能和小鼠Resistin蛋白的获得奠定了基础.     

乙酰肝素酶基因siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的:构建针对人乙酰肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用。方法:设计HPSE靶向的发夹状siRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pRNATU6.1载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染人恶性黑素瘤细胞A375,采用半定量PCR测定HPSE基因RNA水平变化,Western blot检测HPSE蛋白表达的变化。结果:将针对HPSE基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pRNATU6.1载体,经过阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确;转染A375细胞后,半定量PCR和Western blot检测显示,HPSE基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:成功构建了针对HPSE基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制HPSE的表达。     

靶向端粒酶调节相关基因TRAP siRNA表达载体的构建

目的构建靶向端粒酶调节相关基因TRAP的siRNA表达载体。方法根据siRNA设计原则,设计并化学合成2段编码短发夹RNA序列、靶向端粒酶调节相关基因TRAP的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到线性化的pSilencerTM21u6neo质粒U6启动子下游重组构建RNAi质粒。结果重组质粒pSilencerTM21u6neoTRAP经过插入片段基因序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预定位子,并且序列完全一致。结论成功构建靶向TRAP基因的siRNA表达载体,为进一步研究TRAP在调控hTERT的表达、降低端粒酶活性和肿瘤的基因治疗方面的作用做了基础。     

衔接蛋白2基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对衔接蛋白2的μ2亚单位(AP2-μ2)的短链干涉RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对AP2-μ2基因的干涉作用。方法：设计AP2-μ2靶向的发夹状siRNA,据此设计合成3条互补的寡核苷酸链,退火后分别连接到pSilencer 3.1 neo H1载体,转化扩增后进行序列测定。待转染细胞分为对照组、Scramble plasmid、AP2 plasmid-1、AP2 plasmid-2和AP2 plasmid-3组。用脂质体转染法将3组siRNA重组质粒与阴性对照质粒(Scramble plasmid)转染大鼠心肌细胞株H9C2,通过RT-PCR法检测AP2-μ2基因表达水平的变化。结果：合成的6条寡核苷酸单链凝胶电泳显示多个电泳条带,分别退火后,产物经凝胶电泳显示形成单一条带。双链DNA模板与载体质粒连接后,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切,凝胶电泳可见4　300和66 bp的酶切片段。DNA测序连接的核酸序列与设计序列一致,表明AP2-μ2基因的3条siRNA载体构建成功。RT-PCR检测,在AP2 plasmid-1组,转染的H9C2细胞中AP2-μ2的基因表达水平较阴性对照组降低约96%。结论：成功地构建了针对AP2-μ2基因的3条siRNA载体,其中AP2 plasmid-1转染细胞后可显著抑制AP2-μ2基因表达。     

prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建prk基因的非融合表达载体，并诱导表达。方法：PCR扩增并回收prk基因片段，将其与亚克隆载体pMDl8-T重组，通过蓝／白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒，然后从该重组质粒上切下prk基因片段，再克隆至非融合表达载体pBV220中，酶谱分析鉴定出正向重组质粒，诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白，提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果：成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒，经热诱导表达，得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论：pBV220-prk表达载体的成功构建和表达，说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架，使获得天然Prk蛋白成为可能．为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。     

重组真核表达载体介导的mUK基因转移及其在小鼠体内的表达

为研究以基因转移技术治疗血栓性疾病的可能性，将３０只普通级雄性昆明小鼠随机均分为６组，第１￣４组腹腔注射含人小分子量尿激酶（ｍＵＫ）基因的重组质粒ｐｃＤＮＡ３ｍＵＫ，剂量分别为２０、４０、６０和８０ｕｇ／只；第５、６组为对照，分别注射ｐｃＤＮＡ３和转染液。血浆ｍＵＫ活性用Ｓ２３９０发色底物分光光度法测定。注射后，对照组的血浆ｍＵＫ活性无显著变化；第１￣４组的ｍＵＫ活性逐渐升高，第１０天达高峰，峰值     

HBV全基因真核细胞表达载体的构建及表达

目的：构建全基因HBV真核细胞表达载体,并对其在细胞内的复制、转录、翻译进行研究。方法：采用分子亚克隆技术,将长约3.2Kb的HBV全基因克隆到真核细胞表达载体pBK-CMV折EcoPI位点,构建的pKB-HBV经FUGENE^TM6导入人肝癌细胞系SMMC－7721细胞中。结果：经PCR、RT－PCR验证pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制和转录。固相放免法显示HBV转染细胞内的HBsAg、HBeAg的合成和分泌。免疫组化法证明,胸内浆型分布为主的HBcAg的表达。结论：HBV全基因真核细胞表达载体pBK-HBV能够在SMMC－7721细胞中有效复制、转录及表达。     

小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6 27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6 27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6 27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.     

β-arrestin2抗基因RNA表达载体的构建及其基因沉默效应鉴定

目的吗啡耐受与神经元μ阿片受体持续脱敏感化有关,而μ阿片受体调控蛋白β-arrestin2在其中起着关键性作用,因此β-arrestin2有可能成为抑制吗啡耐受状态的有效靶点。文中构建携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体pGPU6/GFP/agRNAs,并评价其用于基因沉默研究的可行性。方法根据β-arrestin2基因转录起始位点序列,从-14处开始至＋13处结束,每隔一个碱基,依次合成9条21个碱基长度的抗基因RNA片段,并分别构建入质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo。利用脂质体Lipofectamine介导的基因转染技术,分别将各个表达载体转染NG108-15细胞,于转染后第5天分别取转染不同抗基因RNA片段的细胞提取总RNA,应用realtime PCR和Western blot检测细胞β-arrestin2的表达,评价其基因沉默效应。结果筛选出1个表达具有基因沉默效应的抗基因RNA表达载体pGPU6/GFP/Arrb9。Realtime PCR结果显示NG108-15细胞转染该片段后,β-arrestin2 mRNA和蛋白表达水平均下降（P〈0.05）,下降程度达95%。结论携带β-arrestin2抗基因RNA的表达载体可有效下调NG108-15细胞β-arrestin2的表达,实现基因沉默效应。     

针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其表达

目的 构建针对人caspase-8 基因mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中caspase8的抑制作用.方法 化学合成针对caspase-8发夹状的RNA寡核苷酸,将其退火形成双链,连接入经HindⅢ和BglⅡ双酶切后的pSUPER真核表达载体.对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定.通过脂质体介导,把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,RT-PCR测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果.结果 成功地构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER-C1和pSUPER-C2,并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase8基因的干涉作用,而且pSUPER-C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER-C2.结论 成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体,转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达.     

SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究

目的：构建人stathmin基困的siRNA真核表达载体,探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用．方法：将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4．1-CMV neo真核表达载体,酶切及测序鉴定．脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,G418筛选后RT—PCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果．结果：经酶切及测序鉴定,成功构建siRNA真核表达载体＋经脂质体转染HeLa细胞后,RT—PCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达,HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低．结论：成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencer—S1和pSilencer—S2,并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用．     

Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

靶向HPV的siRNAs技术治疗宫颈癌研究的现状与挑战

小干扰RNA（small interfering RNAs,siRNAs）是近年来靶向治疗人类乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）的分子生物学研究热点。该技术在抗HPV的靶向性研究中具有高特异性、放大效应、作用稳定、并可遗传等特征,为宫颈癌防治中抗HPV基因治疗提供了新途径。但siRNAs技术研发的核酸药物应用于临床仍面临者许多挑战和尚未解决的问题。今后抗HPV治疗的发展方向和研究重点仍将是采用siRNA技术在HPV相应位点阻断病毒复制,联合抗病毒的全身免疫调节的综合治疗以提高疗效。     

RNA干扰（RNAi）技术及其在功能基因组学研究中的应用

近年来的研究表明 ,一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内某些基因致使mRNA降解 ,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型 ,称为RNA干扰 (RNAinterference ,RNAi)。由于可以作为代替基因敲除的遗传工具 ,RNAi技术正在改变着功能基因组学 (functionalgenomics)领域的研究步伐。《科学》杂志和美国科学促进会将RNAi技术评选为2 0 0 2年十大重大科学成就之首。1　RNAi及其作用机制1.1　RNAi回顾首次发现双链RNA (doublestrandRNA ,dsR NA)能够导致基因沉默的现象来源于对线虫Caenorhabditiselegans的研究。1995年 ,康乃尔大学的…     

小鼠肝脏特异的微RNA在HeLa细胞中的转染与表达

目的观察miR-122在HeLa细胞内表达情况.方法将构建的miR-122真核表达质粒pAVU6 27-mir122以电穿孔法转染HeLa细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Northern杂交和点杂交验证miR-122在HeLa细胞中的表达.结果阳性转染细胞与小鼠肝脏细胞Northern杂交及斑点杂交均出现放射自显影,而转染空质粒的HeLa细胞则无放射显影.结论 miR-122在HeLa细胞中获得正确表达.     

小干扰RNA的靶向运送体系

靶向运送是小干扰RNA（siRNA）药物进入临床应用最关键的环节。研究人员利用配体、抗体和适配子构建了非常有效的靶向特异性细胞组织的siRNA运送体系。制备运送体系分3步：先使脂质体或多聚物与siRNA自发结合形成微粒，利用聚乙二醇等作为桥接分子包被在微粒外层，最后将配体、抗体或适配子等靶向性分子与桥接分子连接。     

siRNAs介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展

RNA干扰（RNAi）是由双链RNA（double-slranded RNA,dsRNA）介导的、序列特异的转录后基因沉默机制,是一古老的细胞反应通路,其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。近年来,短链RNA干扰（siRNAs）已成功地应用于哺乳动物中,该文就其介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展进行综述。     

Smo siRNA对LoVO细胞Smo基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究Smoothened (Smo)小干扰RNA(siRNA)对结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,以及LoVo细胞增殖与凋亡的影响.方法 设计针对目标基因的siRNA.阳性脂质体介导转染LoVo细胞,半定量RT-PCR检测转染后LoVo细胞的Smo mRNA水平,MTT法和流式细胞术检测转染后LoVo细胞的增殖水平及细胞凋亡率.结果 siRNA-1、siRNA-2均能抑制LoVo细胞Smo基因的表达,siRNA-1抑制作用最明显,达63.56%,siRNA-2抑制作用为46.54%,两组与隐性对照组相比.差异均具有显著性.siRNA-1转染LoVo细胞后,细胞增殖水平较隐性对照组显著降低(P＜0.05);转染48 h后,细胞凋亡率较隐性对照组显著升高(P＜0.05).结论 Smo siRNA能有效地抑制结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,可以降低LoVo细胞的增殖水平,诱导细胞的凋亡.     

多发性骨髓瘤特异的APE1siRNA在KM3细胞中的转染与表达

目的观察APE1siRNA在KM3细胞内表达情况.方法将构建的MM特异APE1siRNA表达质粒pSilecer K-IE-IgP APE1siRNA与eGFP以脂质体共转染KM3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Western blot分析验证APE1siRNA在KM3细胞中的表达.结果 MM特异APE1siRNA表达质粒与eGFP共转染,转染效率约为38%～48%,且APE1siRNA转染细胞较对照组能有效敲除APE1基因表达.结论 APE1siRNA在KM3细胞中获得正确表达.