Ⅰ型去乙酰化酶抑制剂MS-275对间充质干细胞C3H/10T1/2成脂分化的影响

目的探讨Ⅰ型去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)MS-275对间充质干细胞(mesen-chymal stem cells,MSCs)成脂分化的影响。方法利用噻唑蓝(MTT)和碘化乙啶(PI)染色结合流式细胞术(FCM)分别检测不同浓度MS-275对C3H/10T1/2细胞活性和细胞周期的影响;油红O染色分析MS-275对C3H/10T1/2细胞成脂分化能力的影响;同时应用实时定量PCR(real-time PCR)检测MS-275对成脂分化标志物:脂结合蛋白(aP2)、围脂素(perilipin)、脂联素(Adipoq),以及成脂分化关键转录因子:过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2(PPAR-γ2)mRNA转录水平的影响。结果随着MS-275浓度升高,其对C3H/10T1/2细胞的抑制率也随着增高,IC50约为8μmol/L(P<0.05);流式结果表明,MS-275将C3H/10T1/2细胞周期阻滞在G0/G1期;0.5μmol/L的MS-275明显减少C3H/10T1/2细胞的脂滴积累;同时成脂分化标志物aP2、perilipin、Adipoq及成脂关键转录因子PPAR-γ2的转录水平也显著降低(P<0.05)。结论 MS-275减弱了间充质干细胞成脂分化的能力,表明抑制Ⅰ型HDACs的活性可部分抑制MSCs向成脂分化。     

重组腺病毒HIV-1 vpr基因的构建和表达

目的 构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使CD4 T淋巴细胞C8166内源性的高表达Vpr蛋白.方法 利用AdEasy-1系统, 通过将含有目的 基因片段的穿梭载体pAdTrack-CMV-vpr和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒Ad-vpr, 用脂质体法将重组质粒转染至HEK293A细胞包装, 获得重组腺病毒Ad-vpr, 荧光显微镜观察Ad-vpr感染C8166细胞GFP的表达 , Western blotting鉴定Vpr在C8166细胞内的特异性表达,流式细胞术检测Ad-vpr感染 C8166细胞的效率.结果 成功构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒 ,Western blotting结果表明重组腺病毒Ad-vpr感染的C8166细胞内源性的高表达Vpr 蛋白,流式细胞术检测结果表明Ad-vpr感染C8166细胞效率高(44.07±3.62)%.结论 成功构建出携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使C8166细胞内源性的高表达Vpr蛋白.     

骨髓间充质细胞与多系分化持续应激细胞的蛋白 质谱分析比较

目的：比较骨髓间充质细胞（hBMSCs）和多系分化持续应激细胞（Muse细胞）蛋白表达的差异。方法：通过密度梯度离心和差速贴壁法从健康人骨髓中分离得到hBMSCs,流式细胞仪检测其中SSEA-3/CD105双阳性细胞;利用长时间胰酶孵育法从hBMSCs中分离得到Muse细胞,利用qPCR技术在mRNA水平检测多能干细胞标记物的表达情况;提取hBMSCs和Muse细胞蛋白,应用iTRAQ标记结合online 2D LC/MS/MS蛋白组学技术定量评估蛋白质表达谱。结果：hBMSCs中SSEA-3和CD105双阳性细胞占0.51%;长时间胰酶孵育法可以成功分离出Muse细胞,悬浮可呈球状生长,且SSEA-3、Sox-2、Oct-4表达均高于hBMSCs;蛋白质谱共检测4 377个蛋白,相对于hBMSCs,Muse细胞有27个上调蛋白和68个下调蛋白。结论：hBMSCs和Muse细胞蛋白表达基本相同,仅有95种蛋白存在差异。     

雷公藤甲素对小鼠淋巴细胞体外活化的抑制作用

目的:研究雷公藤甲素(TRD)对小鼠T淋巴细胞活化标志CD69、CD25及细胞因子IL-2及IFN-γmRNA表达的影响,为阐明其免疫抑制作用提供分子药理学依据.方法:无菌分离小鼠淋巴结细胞,加入不同浓度的雷公藤甲素预先孵育1 h,用多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)刺激T细胞活化,利用荧光标记的单克隆体双染技术,流式细胞仪检测TRD对小鼠T细胞CD69、CD25表达的影响;采用半定量RT-PCR技术从mRNA水平检测TRD对细胞因子IL-2、IFN-γ mRNA的表达的影响.结果:TRD能抑制T细胞早期活化标志CD69和CD25,同时TRD也能抑制IL-2及IFN-γmRNA的表达.结论:TRD对T细胞早期活化分子及细胞因子表达的抑制作用可能是其发挥免疫抑制作用的机制之一.     

子痫前期患者系统性氧化应激反应的检测

目的研究子痫前期系统性氧化应激检测方法。方法组织化学染色检测胎盘组织缺氧表现;用胞内活性氧(ROS)探针H2DCFDA及全血染色方法检测中性粒细胞(PMN)胞内ROS水平;用H2O2检测试剂盒检测血清中H2O2水平。结果与正常妊娠胎盘组织比较,子痫前期患者胎盘组织合胞体细胞显著增多;血管破坏,结构不清,局部血管有纤维钙化特征;非孕妇女、正常妊娠妇女及子痫前期患者PMN胞内ROS水平分别为:45.61±12.20、51.02±13.60(P<0.01)、85.10±16.30(P<0.01);而血清H2O2浓度分别为:(24.57±5.17)μmol/L、(26.61±3.25)μmol/L、(39.84±9.67)μmol/L。结论对子痫前期系统性氧化应激进行定性和定量检测结果与疾病发生和发展一致。     

大鼠肋生长板软骨细胞的分离、培养及生物学特性的研究

目的：建立大鼠肋生长板软骨细胞（RGC）分离、培养的方法，探讨其生物学特性，为软骨细胞增殖分化的调控和软骨组织工程修复的研究建立实验基础。 方法： 显微解剖出大鼠肋生长板软骨，酶消化法获得分散的单个RGC。观察单层培养的不同代数RGC的细胞形态变化,并进行细胞生长动力学分析；组织化学和免疫细胞化学方法检测不同代数RGC蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。 结果： 本实验分离的RGC中活细胞比例大于98%；原代培养细胞呈多角形或圆形，第6代细胞仍保持多角的形态；前4代细胞的每日倍增指数随着传代次数的增加而增加，第5代后显著降低；原代培养的RGC中Ⅱ型胶原阳性染色细胞比例大于95%，阿尔新蓝染色也呈阳性；随着传代次数增加阳性细胞的比例下降。 结论： 本研究所建立的分离培养方法可以获得高纯度、高活性的软骨细胞，前3代RGC保持了在体软骨细胞的表型是研究软骨增殖分化调控的良好材料。     

曲古抑菌素A对SH-SY5Y细胞缺氧/缺糖损伤的保护作用

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)缺氧/缺糖 (oxygen-glucose deprivation,OGD) 损伤的保护作用及其可能机制.方法 采用化学方法建立SH-SY5Y细胞不同时间(1、2、4、6和8 h)持续性OGD损伤模型,MTT法检测细胞活性,以评估持续性OGD损伤对SH-SY5Y细胞的损伤程度.继而观察TSA(10、20、40、80 nmol·L-1)对OGD诱导的神经元损伤的影响,实验指标如下:倒置显微镜观察细胞形态学变化,MTT检测TSA对细胞活性的影响,Propidium iodide(PI)和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡与坏死情况,荧光显微镜检测各组细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量和线粒体膜电位(mitochondrion membrane potential,MMP)的变化.结果 OGD损伤2 h,模型组的细胞活性和MMP水平较对照组明显降低,并随OGD时间的延长而变化越明显.而ROS含量较对照组明显升高,Hoechst 和PI双染检测也发现染色质凝聚,核碎裂,凋亡小体产生,并随OGD时间的延长,凋亡和坏死细胞的数量增加.与模型组相比,40 nmol·L-1 TSA能明显提高OGD诱导的神经元的活性,降低细胞内ROS含量,以及提高MMP水平.结论 TSA对OGD诱导SH-SY5Y细胞缺氧/缺糖损伤具有明显的保护作用,其保护机制可能与降低细胞内ROS水平及维持MMP的高能状态有关.     

ERK信号途径对EGF诱导的HaCaT细胞增殖具有双向调节作用

目的利用带有ERK-2基因的腺病毒载体感染成角质细胞系HaCaT,探讨ERK信号途径在EGF对HaCaT细胞增殖影响中的作用。方法用3H-TdR掺入法检测HaCaT细胞增殖及PD98059对EGF促HaCaT细胞增殖的影响。腺病毒载体转染HaCaT细胞,流式细胞仪检测转染率,W estern b lot检测ERK-2蛋白的表达。结果1μg/L和10μg/L EGF可促进HaCaT细胞增殖,而100μg/L EGF促增殖作用反下降。PD98059抑制EGF引起的HaCaT细胞增殖,且具有浓度依赖性。腺病毒载体具有高转染率,感染Ad-ERK2的HaCaT细胞高表达ERK-2。EGF抑制转染的HaCaT细胞增殖。结论ERK信号途径在EGF促HaCaT细胞增殖中具有双向调节作用。     

分泌型PD-L1真核表达载体的构建、表达及其体外效应的初步研究

目的 构建分泌型PD-L1真核表达载体，并对其生物学活性进行初步研究。方法以RT-PCR方法从孕鼠胎盘中获得程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）配体PD-L1的胞外段基因片段，定向连接于pcDNA3．1上构建真核表达载体pcDNA-PDL1；用脂质体将重组子导入NTT细胞，转染后的NTT命名为NITp。以Western blot鉴定重组蛋白的表达。MTT比色法检测NITp细胞培养上清对同种混合淋巴细胞培养反应的影响；用ELISA试剂盒检测NITp细胞培养上清对反应性T细胞分泌的细胞因子的影响。结果 RT-PCR得到约730bp目的基因片段，测序结果显示该目的基因与Gen-Bank上的序列相符；Western blot分析提示NTTp分泌性表达目的蛋白；NTTp培养上清可抑制混合淋巴细胞增殖，其效应呈剂量依赖性；反应性T细胞分泌的细胞因子检测结果显示，培养上清中IL-4、IFN-γ、IL-2水平降低，与正常对照组差异有统计学意义。结论 成功构建PD-L1基因真核表达载体pcDNA-PDL1，PD-L1蛋白对同种细胞刺激的增殖反应有抑制作用，并可在一定程度上抑制特异性T细胞的活化。     

佛波醇酯加离子霉素诱导脐血和成人外周血CD4+CD25+ T细胞分泌IL-2的相关机制研究

目的：以佛波醇酯加离子霉素作为刺激剂,验证CD4+CD25+ 调节性T细胞本身并不存在分泌IL-2障碍；同时通过对脐血和成人外周 血的比较性研究，了解脐血CD4+CD25+ T细胞的成熟度。方法：以au toMACS从足月婴儿脐血（CB）和成人外周血（PB）分选CD4+CD25+和CD4+CD25-T细 胞，以PDB+ionomycin作为刺激剂，培养45 h后流式细胞术检测各组细胞表达CD69和CD25水 平，并以Luminex多重细胞因子检测技术检测培养上清中7种细胞因子的浓度。结果:经PDB+ionomycin刺激后，CB、PB的CD4+CD25+ 和CD4+CD25- T细胞均 发生增殖，但在培养 45 h 后CD4+CD25+ T细胞均出现细胞状态变差或死亡倾向。C B、PB 的CD4+CD25+ T细胞活化后CD25分子表达进一步上调，高于CD25-细胞活化后的CD25分 子密度。经PDB+ionomycin刺激后，PB CD4+CD25+和CD4+CD25- T细胞均分泌高水平 的IFN-γ、IL-2和TNF-α，但CD25+ 细胞分泌IL-5、IL-4和IL-10水平远远高于CD25-细 胞；CB CD4+CD25+和CD4+CD25- T细胞亦分泌高水平的IL-2和TNF-α，但IFN-γ水 平远远低于PB，基本不分泌IL-5、IL-4和IL-10。结论：CD4+CD25+ T细胞本身并不存在合成和分泌IL-2障碍，其可能具有与传统T细胞不同的T细胞受体信息转 导模式；脐血CD4+CD25+ T细胞功能尚未完全成熟。