腺病毒介导的小鼠内皮抑素治疗胃癌的研究

目的:探讨人血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)对人脐静脉内皮细胞(human umbilican vein endothelia cell,HUVEC)增殖和凋亡的影响,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制.方法:构建pcDNA3.1-V5-HisC-Ang-1真核表达载体,并瞬时转染293细胞;取新生儿脐带经胶原酶消化等方法分离培养HUVEC;分别通过MTT比色和细胞计数法,分析Ang-1瞬时转染上清对HUVEC增殖的影响;通过流式细胞仪分析在血浆饥饿实验条件下,Ang-1对HUVEC凋亡的影响.结果:成功克隆了Ang-1基因,构建了其正义真核表达载体,并在293细胞中瞬时表达;成功进行了HUVEC的原代分离及传代培养;MTT法检测HUVEC增殖结果:只加培养液组、加空载体转染上清组、加Ang-1转染上清组HUVEC OD490值分别为0.36±0.11,0.40±0.03,0.68±0.10(P＜0.05);细胞计数法检测结果依次为:(10.13±2.06)×104,(8.7±1.73)×104,(15.03±1.98)×104(P＜0.05).流式细胞仪检测HUVEC凋亡率依次为:21%,19%和6%.结论:Ang-1能显著促进血管内皮细胞体外增殖,抑制血浆饥饿时HUVEC的凋亡.     

PBL教学法在协和研究生免疫学教学实践中的探索

基于问题的学习(problem-based learning,PBL)教学法在小班教学中易于开展,但如何在大班教学中取得良好的效果值得探索。本研究以研究生大班为对象,设计了一套PBL教学法,并以北京协和医学院研究生《基础免疫学》课程教学为实践模板,将传统讲授式理论授课与PBL教学法相结合,在实际应用中取得了良好的教学效果,为PBL在大班教学中的实践活动,提供了模板和思路。     

LPS触发的TLR4对NF-κB和IRF3信号通路的调控差异

目的探讨脂多糖(LPS)触发的Toll样受体4(TLR4)对NF-κB和干扰素调节因子3(IRF3)信号通路的调控差异。方法 LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞,用免疫荧光法检测TLR4及两种转录因子p65及IRF3的定位,用Western blot方法检测转录因子p65和IFR3的磷酸化水平。结果巨噬细胞经LPS刺激30 min内,细胞膜上的TLR4荧光强度增加(P0.01),胞质中TLR4荧光强度显著增加(P0.01),且与早期内体抗原1(early endosome antigen 1,EEA1)共定位;当LPS刺激90和180 min时,胞膜和胞质内的TLR4信号均显著下降(P0.01),与EEA1共定位的信号也明显减少(P0.01)。静息状态下,TLR4的下游信号通路分子p65和IRF3的荧光信号均出现在胞质中;LPS刺激后,两者的荧光信号在细胞核中逐渐增加(P0.05),但p65荧光信号比IRF3增强得更早,且更持久。p65磷酸化的修饰也明显早于IRF3,且持续时间更长。结论 TLR4活化后的定位变化导致其下游IRF3信号通路的传递时间明显延后,且比NF-κB信号通路短暂。     

miR-147对老龄小鼠巨噬细胞表达促炎性细胞因子的影响

目的探讨miR-147对老龄化小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。方法腹腔注射LPS,用ELISA方法检测老年小鼠和年轻小鼠血清中白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平。分离的老年和年轻小鼠腹腔巨噬细胞经LPS刺激,用实时定量PCR方法检测miR-147的表达水平。在巨噬细胞中过表达和抑制表达miR-147,用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α的表达水平。结果腹腔注射LPS后,老年小鼠血清中促炎性细胞因子IL-6和TNF-α均显著高于年轻小鼠(P0.05)。分离出的腹腔巨噬细胞经LPS刺激后,年轻小鼠细胞中miR-147的表达水平显著上调(P0.05),而在老年小鼠中没有明显变化。巨噬细胞中过表达miR-147后,IL-6和TNF-α的表达水平均显著下降(P0.05),而抑制miR-147的表达,两者均显著上升(P0.05)。结论老年小鼠巨噬细胞中miR-147的表达异常可能是老龄化小鼠表达促炎性细胞因子异常的重要机制。     

靶向性治疗EBV阳性淋巴瘤的腺病毒载体的构建及初步鉴定

目的:构建靶向EBV阳性淋巴瘤且携带野生型P53基因的重组腺病毒.方法:构建重组质粒pDC311.orip-CMV.P53.IRES-EGFP,后将该质粒与腺病毒骨架质粒PBHGE3共转染293细胞,包装成rAd5.orip-CMV.P53.PCR方法对病毒鉴定后,TCID50法测定其滴度,同时用该病毒分别感染EBV阳性Raji细胞和EBV阴性Jurket细胞,以观察病毒的特异性.结果:成功地构建了能表达P53靶向EBV阳性淋巴瘤的重组腺病毒,病毒的滴度为3.6×1012pfu/L.体外细胞实验显示该病毒具有一定特异性.结论:成功构建rAd5.orip-CMV.P53载体,为靶向治疗EBV阳性淋巴瘤奠定基础.     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及体外初步研究

目的　构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。方法　克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1 5 ) ,命名为hA。利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中 ,通过病毒增殖试验、电镜技术、Westernblot分析、鸡胚尿囊膜试验 (CAM ) ,观察CNHK2 0 0 hA的复制情况、hA基因的表达及其对新生血管生成的抑制作用。结果　构建了一种新型的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。该治疗系统为E1b 5 5× 10 3 蛋白缺失而保留了腺病毒E1a蛋白的 5型腺病毒 ,能在肿瘤细胞内大量增殖及复制 ,而在正常细胞内增殖能力较弱 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。同时CNHK 2 0 0 hA携带人抗肿瘤新生血管生成基因hA ,能在肿瘤细胞内高效表达hA蛋白 ,其表达量高于传统基因治疗的腺病毒载体系统。电镜证实该治疗系统可在肺癌A5 49细胞株中复制及增殖。CAM试验证实该治疗系统感染肺癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论　基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能在肿瘤细胞中增殖复制 ,并明显提高hA基因的表达量 ,表达产物具有抑制新生血管形成的作用。     

MiR-146a调节TRAIL不敏感的乳腺癌细胞迁移及其分子机制

目的 研究miR-146a及其靶基因EGFR对乳腺癌细胞迁移的影响.方法 用终浓度为50、100、200和500 μg/L的重组可溶性TRAIL(rsTRAIL)持续刺激对TRAIL敏感的MDA-MB-231细胞4周,筛选得到TRAIL不敏感的乳腺癌细胞MDA-MB-231/TR.RT-PCR检测miR-146a的表达;Transwell实验以及划痕实验检测乳腺癌细胞的迁移能力;双荧光素酶报告基因分析以及Western blot鉴定MDA-MB-231/TR细胞中miR-146a与EGFR基因的靶向调控关系;Western blot检测DR4、DR5、IRAK1、CXCR4、p-IκBα、IκBα、caspase 8和caspase 3的蛋白表达水平;染色质免疫共沉淀技术(ChIP)分析MDA-MB-231和MDA-MB-231/TR细胞中NF-κB P65亚基与miR-146a启动子区的结合情况.结果 TRAIL细胞毒作用不敏感的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231/TR中miR-146a的表达降低,并引起其靶基因EGFR的表达增加,最终导致TRAIL不敏感的乳腺癌细胞迁移能力增强.同时发现NF-κB参与miR-146a低表达的调控.结论 miR-146a对TRAIL不敏感的乳腺癌细胞迁移起重要的调节作用.     

RNAi技术在病毒性疾病和肿瘤治疗中的应用前景

RNA干扰是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制，具有高度特异性。21 nt干扰性小RNA在哺乳动物细胞中可以诱导强有力的特异性RNM作用，这一突破性研究进展开创了人类疾病治疗的新天地，RNM技术用于人类疾病治疗已受到极大关注，尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等病毒感染性疾病和肿瘤治疗中的应用研究最为活跃，并取得了令人鼓舞的成果。本文对siRNA的设计和制备的基本思路，及其在病毒性疾病和肿瘤治疗中的研究进展作一综述。     

miR-23a对LPS诱导小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子表达的影响

 目的 探讨miR-23a对LPS诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞促炎性细胞因子表达的影响。方法 Real-time PCR定量分析LPS刺激不同时间的腹腔巨噬细胞中miR-23a的表达以及瞬时转染miR-23a mimics和inhibitors的腹腔巨噬细胞中IL-1?、IL-6和TNF-?等促炎性细胞因子的表达;ELISA检测mRNA变化明显的细胞培养上清的IL-6的含量。结果 原代腹腔巨噬细胞在LPS刺激后,miR-23a的表达明显下调;在转染miR-23a mimics后,IL-6的表达和分泌明显升高 (P <0.05),但对IL-1?和TNF-?的表达没有明显影响。而转染miR-23a inhibitors后,则IL-6的表达水平受到抑制。结论 LPS刺激原代巨噬细胞可抑制miR-23a的表达;miR-23a可促进炎性细胞因子IL-6的表达,对IL-1?和TNF-?无显著影响。