抗纤灵方通过PI3K/AKT/mTOR信号通路干预肾纤维化机制研究

目的:研究抗纤灵方对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响及抗肾纤维化作用机制。方法:将60只C57小鼠,随机分为假手术组10只和手术组50只,手术组行5/6肾切除术。术后2周,手术组随机分为模型组、抗纤灵低、中、高剂量组及雷帕霉素阳性药组,各组10只。假手术组给予0.5 mL生理盐水ig,抗纤灵方低、中、高剂量组分别给予0.5 mL抗纤灵药物ig(0.1,0.2,0.4 mg·kg-1),阳性药组给予0.5 mL雷帕霉素ig(0.016μg·kg-1),ig 12周后处死小鼠,在处死小鼠前1 d收集24 h尿液检测24 h蛋白定量,眼眶采血测血肌酐、尿素氮,取残肾采用HE观察肾脏组织形态改变,PCR法检测肾组织中PI3K/AKT/mTOR mRNA表达。结果:与假手术组比较,模型组24 h尿蛋白定量,血肌酐,尿素氮,PI3K/AKT/mTOR mRNA表达均显著升高(P0.01),肾脏病理形态改变明显;与模型组比较,各治疗组24 h尿蛋白定量,血肌酐,尿素氮,PI3K/AKT/mTOR mRNA表达均下降(P0.05),肾脏组织学形态改善。结论:抗纤灵方能降低小鼠24 h尿蛋白定量,改善肾功能,延缓肾纤维化发生;其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路表达相关。     

SD大鼠与C57小鼠5/6肾切除慢性肾功能衰竭动物模型的比较研究

目的：比较SD大鼠、C57小鼠建立5/6肾切除（5/6 nephrectomy,5/6NX）慢性肾功能衰竭动物模型的异同,选择合适的实验动物以供慢性肾功能衰竭的防治研究。方法：将60只SD大鼠和60只C57小鼠分别随机、平均分成5/6肾切除组和假手术组,分别于术后4周、8周、12周三个时间点处死各组老鼠,收集血清和肾组织供肾功能、α-SMA检测分析。结果：大、小鼠模型组成活率不存在差异（P>0.05）,大鼠5/6NX组血清肌酐及尿素氮值于8-12周出现稳定状态,异于小鼠5/6NX组。结论：C57小鼠5/6肾切除慢性肾衰模型建立成功。5/6NX大、小鼠组均于术后出现进行性肾功能减退的表现,然其疾病进程不尽相同,临床应根据监测周期长短选择合适的实验动物以准确地反应疾病状态。     

抗纤灵对5/6肾切除小鼠转化生长因子-β及其下游因子表达的影响

目的观察抗纤灵对5/6肾切除小鼠肾组织转化生长因子-β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法随机从50只C57小鼠中取40只建立5/6肾切除慢性肾衰肾纤维化模型,术后2周根据肌酐值将40只小鼠分为抗纤灵低、中、高剂量治疗组和模型组,每组10只。另10只小鼠为假手术组。治疗12周后,用western blot法、RT-q PCR法分别测定各组小鼠肾组织TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表达水平。结果模型组小鼠肾组织TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表达较假手术组升高(P0.01);与模型组比较,抗纤灵中、高剂量组小鼠肾组织TGF-β及CTGF蛋白、mRNA表达下调(P0.01),两剂量组间TGF-β、CTGF的蛋白及mRNA表达差异无统计学意义(P0.05)。结论抗纤灵中、高剂量治疗组均能下调5/6肾切除小鼠肾组织TGF-β、CTGF蛋白及mRNA表达,两剂量治疗组间尚不存在量效相关性。提示抗纤灵可能通过调控TGF-β及其下游因子延缓肾纤维化,保护残肾功能。     

温阳消癥方对单侧输尿管梗阻小鼠肾间质纤维化的影响

目的:研究温阳消癥方对单侧输尿管结扎小鼠肾功能及肾组织病理的影响。方法:32只C57小鼠随机抽取8只作为假手术组,其余24只采用单侧输尿管结扎法制作肾间质纤维化模型。造模成功后随机分为模型组、缬沙坦组、温阳消癥方组,每组8只,分组给药,治疗2周后眼眶采血并测定血清肌酐、尿素氮,同时取肾组织进行HE、Masson染色,观察肾脏病理改变。结果:与假手术组相比,模型组的血清肌酐、尿素氮水平明显升高(P <0. 001),肾间质纤维化改变明显,胶原染色阳性率百分比升高(P <0. 001);与模型组比较,缬沙坦组和温阳消癥方组的血清肌酐、尿素氮水平均有明显下降(P <0. 001),肾组织纤维化程度较轻,胶原染色阳性率百分比下降(P <0. 001);温阳消癥方组疗效优于缬沙坦组。结论:温阳消癥方能改善UUO小鼠的肾功能,减轻肾间质纤维化,其效果好于缬沙坦胶囊。     

温阳消癥方对5/6肾切除小鼠肾功能及肾组织病理的影响

目的:观察温阳消癥方对5/6肾切除小鼠肾功能、24 h尿蛋白定量及肾组织病理改变的影响。方法:随机从32只小鼠中取24只制作5/6肾切除慢性肾衰竭肾纤维化模型,2周后根据血清肌酐值将24只小鼠分为模型组、代文组和温阳消癥方组,另8只作为假手术组。治疗8周后,测定所有小鼠血清肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白定量,并观察肾组织病理改变。结果:治疗8周后,模型组小鼠血清肌酐、尿素氮,24 h尿蛋白定量及肾组织胶原阳性率百分比均较假手术组上调(P0.001);与模型组相比,代文组、温阳消癥方组血清肌酐、尿素氮,24 h尿蛋白定量及肾组织胶原阳性率百分比均下调(P0.001),而上述指标在两治疗组间尚差异无统计学意义(P0.05)。结论:温阳消癥方能够下调5/6肾切除小鼠血清肌酐、尿素氮,24 h尿蛋白定量及肾组织胶原阳性率百分比,其治疗效果与代文尚不存在统计学差异。提示温阳消癥方能够通过改善5/6肾切除小鼠肾功能延缓其慢性肾衰竭、肾纤维化的发病进程。     

温阳消癥方对5/6肾切除小鼠肾纤维化的作用及其机制

目的：观察温阳消癥方对5/6肾切除小鼠残肾功能及肾脏纤维化的影响,并探讨其作用机制。方法：随机从32只小鼠中取24只制作5/6肾切除慢性肾功能衰竭肾纤维化模型,2周后根据血清肌酐值将24只小鼠分为5/6肾切除组、代文组和温阳消癥方组,另8只作为假手术组。治疗8周后,Western blot检测各组小鼠肾组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad3、I型胶原蛋白（Col-I）、III型胶原蛋白（Col-III）、α-SMA蛋白表达水平,免疫组织化学染色法测定小鼠肾组织Col-I、Col-III、α-SMA水平,用RT-qPCR法测定TGF-β1、Smad3 mRNA水平。结果：治疗8周后,模型组小鼠肾组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1、Smad3、Col-I、Col-III、α-SMA蛋白表达均较假手术组上调（P＜0.01）,模型组小鼠肾组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达较假手术组上调（P＜0.01）;与模型组比较,代文组、温阳消癥方组JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1、Smad3、Col-I、Col-III、α-SMA蛋白表达和TGF-β1、Smad3 mRNA表达均下调（P＜0.01）;与代文组比较,除TGF-β1、α-SMA外,温阳消癥方组其余指标均下调（P＜0.01）。结论：温阳消癥方能够保护5/6肾切除小鼠残肾功能,减轻肾纤维化病变程度,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3、JAK2/STAT3通路相关。     

抗纤灵对5/6肾切除诱导的慢性肾纤维化小鼠Akt-mTOR信号通路的影响

  目的：观察抗纤灵对5/6肾切除诱导的慢性肾脏纤维化小鼠磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)及Akt,mTOR mRNA表达的影响,从Akt-mTOR信号通路角度探讨抗纤灵的作用机制  方法：C57BL/6J雄性小鼠采用5/6肾切除制备慢性肾脏纤维化模型。2周后根据肌酐水平将手术组小鼠分为模型组、雷帕霉素组和抗纤灵组,同时设立假手术组,每组10只。雷帕霉素组、抗纤灵组分别给予雷帕霉素(0.8 μg/g)、抗纤灵(20 g/kg)每天0.5 ml灌胃治疗,模型组和假手术组灌胃等量蒸馏水。连续用药8周后处死小鼠,检测各组小鼠肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24小时尿蛋白(24 h UP)含量;采用蛋白质印迹法(Western blotting)、RT-PCR检测肾脏组织中p-Akt、p-mTOR蛋白及Akt、mTOR mRNA的表达  结果：与假手术组比较,模型组Scr、BUN、24 h UP、p-Akt、p-mTOR蛋白及Akt、mTOR mRNA显著升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,雷帕霉素组、抗纤灵组Scr、UN、24 h UP、 p-Akt、p-mTOR蛋白及Akt, mTOR mRNA均有所降低(P<0.05, P<0.01)。雷帕霉素组与抗纤灵组比较,在降低Scr、24 h UP方面,抗纤灵组明显优于雷帕霉素组(P<0.05);在降低p-mTOR蛋白及mTOR mRNA方面,雷帕霉素优于抗纤灵组(P<0.05)  结论：抗纤灵可能通过调节Akt-mTOR信号通路,对肾纤维化有一定的改善作用。     

温阳消癥方调控LncRNA MEG3对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化因子的影响

目的:探讨温阳消癥方对TGF-β₁诱导的人近端肾小管上皮细胞LncRNA MEG3的调控作用及对纤维化因子的影响。方法:体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2),分为对照组、TGF-β₁组、TGF-β₁+3.5 mg/ml温阳消癥组、TGF-β₁+14 mg/ml温阳消癥组，MTT法检测细胞增殖，实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)及结缔组织生长因子(CTGF)mRNA及长链非编码RNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)表达，蛋白质印迹法检测α-SMA、FN、CTGF蛋白表达。结果:3.5、7、14 mg/ml温阳消癥不影响细胞增殖，35 mg/ml组细胞增殖明显降低(P<0.01);与对照组比较，TGF-β₁组中α-SMA、FN、CTGF mRNA、LncRNA MEG3及FN、CTGF蛋白表达显著升高(P<0.01),α-SMA蛋白表达升高(P<0.05);与TGF-β₁     

抗纤灵水煎剂对慢性肾衰模型小鼠PI3K-AKT-mTOR mRNA表达的影响

目的:探讨不同剂量的抗纤灵水煎剂对慢性肾衰模型小鼠磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸及苏氨酸蛋白激酶(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)mRNA表达的影响,并探讨其作用机制。方法:C57BL/6J小鼠50只采用5/6肾切除制备慢性肾脏纤维化小鼠模型,同时设立假手术组10只,造模成功的小鼠随机分为模型组,雷帕霉素组(0.8 mg·kg~(-1)),抗纤灵水煎液低、中、高剂量组(10,20,40 g·kg~(-1)),连续ig 8周后处死小鼠,苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理改变,实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)检测PI3K-AKT-m TOR mRNA表达的含量。结果:与假手术组比较,模型组小鼠肾组织纤维化组织增多,肾损伤评分明显升高,PI3K-AKT-m TOR mRNA表达明显增强,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组和抗纤灵各剂量组肾组织纤维化减轻,PI3K-AKT-m TOR mRNA表达明显下降(P0.05,P0.01);与雷帕霉素组比较,抗纤灵水煎液中、高剂量与雷帕霉素组间无显著性差异,低剂量组疗效差于雷帕霉素(P0.05),高、中、低剂量组比较,低剂量组与高、中剂量组之间有明显差异(P0.05),高、中剂量组之间无显著性差异。结论:抗纤灵水煎液可降模型小鼠表达PI3K-AKT-m TOR mRNA的表达,减轻肾脏纤维化纤维化,抗纤灵水煎液中、高剂量与和雷帕霉素等同。     

抗纤灵治疗慢性肾功能衰竭的动物实验研究述评

抗纤灵是何立群教授多年的经验方,经反复临床实验证明,具有较好的临床疗效。近10年来,笔者在不断总结其疗效的基础上,采用不同的造模方式,运用不同品系的动物,采取不同形式的给药途径,围绕着引起肾纤维化的四大因素,从致炎因子或炎症因子、促纤维因子(细胞因子,生长因子,血管活性因子的表达,趋化黏附因子)、纤维化形成因子、肾结构和功能改变等方面着手,结合信号通路,对抗纤灵机制及疗效做了详细的观察和探讨,结果表明抗纤灵能够通过部分信号通路,影响肾纤维化的部分指标,进而抑制肾脏纤维化,延缓肾功能衰竭。同时,通过总结,发现仍有许多需要改进的地方,为今后抗纤灵的进一步研究提供新的思路和方向。