miR-20a-5p调控结核分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡相关基因表达的研究

目的 明确小非编码RNA(microRNA,miR-20a-5p)对结核分枝杆菌(MTB)诱导人巨噬细胞凋亡相关基因表达的调控作用。方法 构建可表达或抑制miR-20a-5p、转染miR-20a-5p抑制剂(miR-20a-5p-inhibitor,简称“miR-20a-5p-inh”)、作为慢病毒载体的阴性对照(LV1-NC)的慢病毒载体,由oligo-dT引物通过固相亚磷酰胺法合成茎环寡核苷酸,并克隆到含绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体pGLV3-GFP内,将构建的miR-20a-5p、miR-20a-5p-inh、LV1-NC转染THP-1人巨噬细胞3h,培养72h后用流式细胞仪分选出GFP+THP-1细胞,并分别采用减毒MTB菌株(H37Ra)感染8h和过氧化氢(H₂O₂)处理30min 两种方法诱导。通过实时定量PCR技术测定细胞中线粒体相关抗凋亡基因Bcl-2,以及促凋亡基因Bax、Bim和Bad的转录水平。同时,用蛋白免疫印迹法检测细胞裂解物中相关蛋白的表达。结果 慢病毒转染细胞后,在无刺激的THP-1细胞中miR-20a-5p的相对荧光强度值为12.21±1.29、miR-20a-5p-inh为9.68±1.38、LV1-NC为10.64±0.96,三者的表达差异均无统计学意义(q=1.815,P=0.385;q=2.072,P=0.602);但在H37Ra和H₂O₂的刺激后,miR-20a-5p过表达时其相对荧光强度值分别为7.20±0.53、8.55±0.82,明显高于LV1-NC (4.46±0.07、5.49±0.44)(q=50.250,P=0.007;q=1.041,P<0.01),miR-20a-5p受抑制时(1.88±0.08、1.44±0.21)明显低于LV1-NC(q=3.457,P=0.031;q=4.384,P=0.001)。在感染miR-20a-5p慢病毒的THP-1细胞中,H37Ra诱导Bcl-2的表达增加(相对荧光强度值由10.67±0.89增至14.98±0.88)(q=1.064,P=0.008),而感染miR-20a-5p-inh慢病毒时Bcl-2表达减少(由10.67±0.89降至6.49±0.47)(q=3.518,P=0.003);在miR-20a-5p过表达的THP-1细胞中Bim的转录水平减少(由1.22±0.05降至0.98±0.04)(q=1.240,P=0.011),当miR-20a-5p受抑制时Bim的转录水平增加(由1.22±0.05增至1.51±0.08)(q=2.460,P=0.021)。蛋白印迹法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bim的蛋白表达水平,结果与基因转录水平相符。 结论 miR-20a-5p的表达水平影响MTB诱导的巨噬细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bim的表达,并且与促凋亡基因Bim的水平呈负相关,提示miR-20a-5p可能通过调控Bim的表达而影响细胞凋亡。     

射频消融后HIF-1a调控小细胞肺癌移植瘤增殖的机制研究

目的 探讨射频消融形成的消融灶周边移行区域内缺氧诱导因子1a(hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)的表达情况,以及HIF-1a表达对移行区域内小细胞肺癌微转移瘤增殖及免疫反应的影响。方法 骨髓腔注射人NCI-H446小细胞肺癌细胞建立转移性人小细胞肺癌裸鼠模型,30 d后经皮穿刺行右肺上叶RFA处理,同时腹腔注射 HIF-1a特异性抑制剂3-(5’-羟甲基-2’呋喃基)-1-苯甲基吲唑(YC-1)抑制其表达,7 d后观察各组指标。实验分为未处理组（对照组）、YC-1处理组,RFA处理组、RFA+YC-1组。将消融形成的中央坏死灶移行至正常肺组织2~3 mm的区域定义为移行区域,检测此区域内微转移瘤的负荷率(PRA),免疫组织化学法检测HIF-1a蛋白水平。切取坏死灶周边2~3 mm厚的组织切片,Realtime PCR检测HIF-1a和血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)mRNA表达。结果 建模成功的裸鼠可见明显的人小细胞肺癌转移瘤分布。RFA组中右肺上叶移行区域内转移瘤的PRA值及HIF-1a,表达水平均明显高于右肺上叶对照区域(P<0.05),亦高于对照组右肺上叶移植瘤组织(P<0.05),此外RFA+YC-1组移行区域内PRA值及HIF-1a明显低于RFA处理组(P<0.05)。虽然RFA+YC-1组移行区域和对照区域内的VEGF-A mRNA表达水平明显均低于RFA组(P<0.05),但是RFA组移行区域及对照区域内的VEGF-A mRNA表达无显著差异(P>0.05)。结论 小细胞肺癌在接受射频消融处理后消融灶周边的肿瘤局部复发现象与移行区域内HIF-1a 表达密切相关,但这一过程与HIF-1a 介导的血管生成效应无明显关系,而与HIF-1a参与调控的肿瘤免疫反应可能存在相关性。     

深圳献血员结核分枝杆菌潜伏感染调查研究

目的了解深圳献血员结核分枝杆菌潜伏感染的情况和相关特点。方法使用ELISPOT技术检测结核分枝杆菌特异性IFN-γ来了解1503例合格献血员结核分枝杆菌潜伏感染情况。结果 1503例合格献血员中有148例为结核分枝杆菌潜伏感染阳性,阳性率为9.85%,男性与女性阳性率没有差异,年龄在25岁以下人群阳性率低于年龄在25岁以上人群。结论献血员结核分枝杆菌潜伏感染问题不容忽视。     

结核菌特异性IFN-γ检测在骨关节结核诊断中的初步应用

目的探讨酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测结核特异性IFN-γ在骨关节结核病患者中的诊断价值。方法收集2009年5月至2011年5月期间,深圳市第三人民医院收治并确诊为骨关节结核病患者及其临床资料,共90例,比较分析ELISPOT检测、涂片染色镜检、结核菌培养、聚合酶链反应（PCR）检测结核菌DNA以及病理检查诊断在骨关节结核病中的阳性率。结果 90例临床确诊骨关节结核患者中,ELISPOT检测阳性率为75.6%,涂片染色法（27.9%）,结核菌培养法（51.7%）,聚合酶链反应PCR（53.0%）,病理诊断（39.1%）,ELISPOT阳性率显著高于其它临床常用检测方法,差异有统计学意义（P〈0.05）;ELISPOT联合涂片染色法、结核菌培养法及PCR检测法,阳性率分别达到80.9%、88.3%、87.9%,当ELISPOT、结核菌培养法和PCR检测法三者联合应用时,阳性率高达90.7%。结论 ELISPOT检测方法在骨关节结核患者中有一定辅助诊断价值,与临床常规检测方法相结合有助于提高诊断率。     

白细胞介素-22基因单核苷酸多态性与肺结核易感性的相关性研究

目的 探讨IL-22基因单核苷酸多态性(SNP)与肺结核易感性的关系.方法 选取2009年1月至2010年12月深圳市第三人民医院收治并确诊的肺结核患者479例为病例组,其中男212例,女267例;年龄18～ 69岁,平均(36±17)岁;对照组为同期在该医院体检者358名,其中男162名,女196名,年龄18～60岁,平均(34±13)岁.应用MassARRAY时间飞行质谱生物芯片技术,检测IL-22基因6个SNP位点(rs1182844、rs2227473、rs2227476、rs2227480、rs2227485和rs2227508)基因型,对SNP位点进行Hardy-Weiberg平衡检验,并计算各SNP位点等位基因频率及比值比.选取rs2227473不同基因型肺结核患者外周血单个核细胞(PBMC),使用抗人CD3和CD28抗体联合刺激后,采用ELISA法测定不同基因型患者细胞上清液中IL-22浓度.分别采用x2检验和t检验对两组SNP等位基因频率和IL-22浓度进行统计学分析.结果 病例组和对照组6个IL-22基因SNP位点的基因型分布均处于遗传平衡状态.其中rs2227473位点存在GG、GA和AA基因型,病例组仅有等位基因G频率(90.0％,862/958)显著高于对照组(85.6％,613/716),差异有统计学意义(x2=7.448,P ＜0.01,OR=1.509,95％CI-1.121～2.030).rs2227473位点GG基因型的PBMC培养上清液中IL-22浓度为(19 ±5) ng/L,显著低于AA/GA基因型的(39±6)ng/L,差异有统计学意义(t=2.686,P＜0.01).结论 IL22基因rs2227473多态性与肺结核易感性有显著相关性,其等位基因G是肺结核的易感基因.rs2227473多态性影响宿主PBMC的IL-22表达水平,在调节肺结核保护性免疫过程起重要作用.