携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察

目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.     

重组人KGF基因减毒沙门氏菌菌株的构建及鉴定

目的 构建携带人角质细胞生长因子(KGF)基因真核表达载体的减毒沙门氏菌,并进行稳定性检测及体外表达鉴定,为探索制备针对高原急性肺损伤的细胞因子保护剂提供理论和实验依据.方法 采用RT-PCR法从正常人皮肤组织总RNA扩增出KGF cDNA全长,测序正确后将其定向插入到pcDNA3.0(+)质粒BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间;以电转化法将构建成功的质粒转化入减毒沙门氏菌Ty21a中,获得重组减毒沙门氏菌菌株TPK,并将其在卡那霉素(+)和卡那霉素(-)的LB培养板上分别传代培养40代,每隔10代提取质粒进行PCR及酶切鉴定;TPK菌株转染A549细胞,转染24 h及48 h后以RT-PCR及ELISA法检测KGF基因及蛋白表达水平.结果 成功构建了携带KGF基因的重组减毒沙门氏菌TPK,其可稳定遗传,不因无选择性压力而使质粒丢失,并能在体外稳定表达KGF基因及蛋白.结论 携带KGF基因减毒沙门氏菌TPK的成功构建和体外稳定表达为进一步研究角质细胞因子KGF对肺损伤的保护作用提供了实验依据.     

Sry基因监测腺病毒介导肝细胞生长因子修饰的骨髓间充质干细胞移植在大鼠烫伤创面愈合中的作用

目的 制备地高辛标记的Sry探针,监测局部异体移植携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在烫伤创面愈合中的作用.方法 用雄性大鼠肝组织通过聚合酶链反应法克隆Sry基因,并将其构建至T Easy Vector上,用地高辛标记法制备Sry基因原位杂交探针.密度梯度离心法体外分离培养雄性Wistar大鼠BMSCs,并转染Ad-HGF.复制16只背部深Ⅱ度烫伤雌性大鼠模型,于造模成功后,将Ad-HGF修饰的BMSCs一次性多点注射于创面真皮下.21 d后,处死大鼠,取愈合创面新生组织和正常组织制作石蜡切片,原位杂交法检测组织切片中Sry基因的表达.结果 ①从8只雄性大鼠中成功克隆出Sry基因;②制备出地高辛标记的Sry探针;③16只雌性大鼠深Ⅱ度烧伤模型复制成功,用Ad-HGF修饰的BMSCs治疗后,原位杂交法证实全部雌鼠创面新生组织中有Sry表达,而正常组织中未检测到.结论 外源移植的BMSCs参与了大鼠烫伤创面的修复,Sry基因可作为细胞追踪标记,为细胞治疗追踪技术及利用BMSCs治疗创伤的研究提供依据.     

NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性与冠心病关联性的荟萃分析

目的探讨NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性与冠心病(CHD)的关联性。方法计算机检索Pub Med、CNKI、万方等数据库,获取有关NFKB1基因启动子区-94 ins/del ATTG多态性与CHD关联性的病例-对照研究,用Stata 11.0软件在等位基因、纯合子、显性和隐性基因模型下进行荟萃(meta)分析。根据异质性检验结果选择固定或随机效应模型进行数据合并,并采用Begg's漏斗图和Egger's检验评价发表偏倚。结果共纳入8篇文献,研究对象共14 649例;Meta分析结果显示,携带D等位基因的人群,CHD易感性增加(OR=1.28,95%CI=1.22~1.35,POR0.01);基因型为DD的人群发病风险高于II基因型(OR=1.32,95%CI=1.19~1.47,POR0.01);显性模型中DD+ID基因型的人群发病风险高于II基因型的人群(OR=1.15,95%CI=1.07~1.24,POR0.01);隐性模型中DD基因型的人群发病风险高于ID+II基因型(OR=1.26,95%CI=1.15~1.38,POR=0.002)。亚组分析结果显示,NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性与CHD易感性在亚洲及欧洲人群中有关联,而在北美洲人群中并未表现出这种相关性。结论 NFKB1基因启动子区-94ins/del ATTG多态性与CHD的易感性显著相关,但主要表现在亚洲和欧洲人群。     

官腔脱落细胞中p53、ki-67、bcl-2、bax基因的表达及意义

目的 采用实时荧光定量PCR法检测p53、ki-67、bcl-2、bax基因在子宫内膜癌及正常人官腔脱落细胞中的表达变化水平,探讨官腔脱落细胞中p53、ki-67、bcl-2、bax基因的表达变化在子宫内膜癌早期诊断中的意义.方法 收集健康志愿者及子宫内膜癌患者官腔脱落细胞样本共90例;提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测目的基因的表达变化水平;所有实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析.结果 荧光定量PCR结果显示,p53基因在正常人官腔脱落细胞中未检测到表达,随着恶性程度升高,表达量显著升高(P＜0.01),ki-67的表达在正常人中表达量最低,随着恶性程度升高,表达量逐渐升高(P＜0.05),bcl-2基因的表达逐渐降低(P＜0.05),bax/bcl-2值随着恶性程度增高而降低.结论 p53、ki-67、bcl-2、bax基因的表达量在子宫内膜癌发生发展过程中呈一定的变化趋势,提示p53、ki-67、bcl-2、bax基因可作为子宫内膜癌早期诊断的分子标志物.     

实时荧光定量PCR检测宫腔脱落细胞中P27~(kip1)及cylin E基因的表达及意义

目的探讨宫腔脱落细胞中P27kip1、cyclin E基因的表达在子宫内膜癌早期诊断中的意义。方法收集健康志愿者及子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞样本共80例;提取总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测目的基因的表达,比较健康志愿者及子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞中P27kip1、cyclin E基因表达量的差异。结果荧光定量PCR结果显示,P27kip1基因在健康志愿者宫腔脱落细胞中的表达显著高于子宫内膜癌患者,差异有统计学意义(P0.05),并随恶性程度升高,P27kip1的表达水平降低,两者比较差异有统计学意义(P0.05);cyclin E基因的表达随恶性程度的增高而增高,两者比较差异有统计学意义(P0.05)。结论联合检测P27kip1和cyclin E基因可作为子宫内膜癌早期诊断的依据。