CD49f剪接异构体在不同细胞系中的表达

目的比较CD49f选择性剪接异构体在人不同来源干细胞以及结肠癌细胞系中的表达,并构建特定异构体过表达载体用于功能研究。方法 RT-PCR及real-time PCR检测CD49f选择性剪接异构体在不同细胞中的表达;分子克隆方法构建各异构体的慢病毒过表达载体;流式细胞计量术、Western blot及real-time PCR检测CD49f各异构体的过表达;Transwell方法检测细胞侵袭能力的改变。结果人胚胎干细胞系H9中表达CD49f异构体B,而上皮类细胞仅表达异构体A;间质细胞中二者均有表达,但异构体A表达多于异构体B;检测的4个结肠癌细胞系中CD49f异构体A和B均有表达,其中HT29和HCT116中以异构体A为主,而HCT8和LoVo中异构体B的表达更为明显。构建的慢病毒表达载体可使HT29中CD49f异构体A和B获得特异性过表达,其中异构体B的过表达使HT29的侵袭能力增加。结论不同类型细胞中CD49f选择性剪接异构体A和B的表达存在显著差异,二者的生物学功能具有差别。     

富含血小板血浆双相接种法构建组织工程骨

目的：传统的细胞接种法接种效率低,影响组织工程骨的成骨质量。本研究预探讨富含血小板血浆双相接种法是否可以提高细胞接种效率、优化组织工程骨的构建。方法：分别用富含血小板血浆、乏血小板血浆重悬BMSCs,灌注于三维多孔PLGA支架中,凝血酶促凝,体外培养。通过扫描电镜观察支架表面的细胞分布;通过检测支架内DNA含量、ALP含量、成骨基因表达情况分析细胞的接种效率、增殖和分化情况,并与传统的接种方法进行比较。结果：富含血小板血浆和乏血小板血浆双相接种法均能提高细胞与三维支架的结合效率;富含血小板血浆还可以促进支架内细胞的增殖,同时不影响细胞的分化。结论：双相接种法可以提高细胞的接种效率;与普通双相接种法相比,富含血小板血浆双相接种法可以进一步优化组织工程骨的构建。     

不同来源的人脂肪干细胞体外成脂诱导分化能力的比较

目的：对同一个体不同部位来源的脂肪干细胞体外成脂诱导分化的能力进行比较，为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。 方法：实验于2004-11／2005-05在中国协和医科大学整形外科医院研究中心完成。提取5例女性临床吸脂患者（平均年龄32岁）8个部位（大腿前侧、臀上部；臀上部、上腹部；髂腰部；上腹部；背部、上臂）脂肪抽吸组织中的间充质干细胞，体外进行成脂诱导分化。在对照培养基（含体积分数0．1胎牛血清的DMEM培养基）中培养的第l代脂肪干细胞，以3&;#215;10^-4细胞／皿接种到35mm培养皿中，将对照培养基更换为成脂诱导培养基，进行成脂诱导，每周换液2次，以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周，分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红O染色，以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红O染色及阳性细胞记数，分别对来源于3例患者的2个不同部位的脂肪抽吸标本中的脂肪干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测，采用卡方检验对不同细胞的成脂诱导分化率进行测定。 结果：①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果：从不同个体的每100mL脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同，从2.45&;#215;10^8-／100mL-1.25&;#215;10^9个／100mL不等；但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似；根据各例细胞成脂诱导分化率，可得出5例患者8个部位细胞的平均成脂诱导分化率为36．2％。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力，获得的平均干细胞数目与年龄无关（r=0．098，P=0．817），而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关（r=-0．568，P〈0．01。②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红O染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大，分化为成脂细胞，细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴，多者可占整个细胞体积的80％-90％，细胞核缩小或偏于细胞的一侧，呈阳性；而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成，呈阴性。 结论：患者年龄越大，成脂分化率越低，且同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时，在患者年龄和取材部位上应有所选择，进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。     

人脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的实验研究

目的了解从人体抽吸的脂肪组织中获得的脂肪干细胞在体外向成脂和成软骨细胞诱导分化的情况。方法临床提取8例人脂肪抽吸组织中的间充质干细胞,在体外分别进行成脂和成软骨诱导分化,并通过油红O染色、阿尔辛蓝染色和免疫组化的方法进行证实。结果脂肪干细胞经成脂诱导后,向成脂细胞分化,细胞内出现油红O染色阳性脂滴;经成软骨诱导后,细胞向成软骨细胞分化,分泌软骨特异性基质成分硫酸蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。结论在适当的诱导条件下,来源于人体多部位脂肪抽吸组织中的干细胞具有向成脂和成软骨细胞分化的能力,本实验为进一步应用人体脂肪干细胞进行脂肪和软骨组织工程研究打下实验基础。     

敲减PTGS2对皮肤成纤维细胞基因表达谱的作用

 目的 运用RNAi干扰正常皮肤成纤维细胞前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)基因的表达,应用基因芯片技术研究其对成纤维细胞全基因组表达谱的影响,在基因水平上探索防治瘢痕疙瘩的新途径。方法 对成纤维细胞PTGS2基因进行siRNA干扰,利用RealTime RT-PCR验证siRNA沉默效果;应用全基因组芯片检测基因表达谱变化。结果 成纤维细胞的PTGS2基因经siRNA干扰后,其mRNA表达水平明显下调;全基因组芯片表达谱检测到的差异表达基因,按1.5倍差异共189个（115个上调,74个下调）,按2倍差异共14个（9个上调,5个下调）;基因表达谱的变化与瘢痕疙瘩基因表达谱的变化相吻合,可能促使正常皮肤成纤维细胞向瘢痕疙瘩方向进展。结论 检测到与PTGS2基因相关的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同发挥作用的相关基因,证明PTGS2与瘢痕疙瘩的发病机制有着密切的关系,为治疗瘢痕疙瘩提供了一个潜在的候选靶点。     

KLF2和KLF15基因在hBMSCs定向分化中的动态表达

目的研究KLF2和KLF15在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成脂、成骨和成肌分化过程中的表达水平及变化趋势,探讨KLF2和KLF15在hBMSCs定向分化过程中可能的作用方式。方法密度梯度离心法分离hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第4代细胞分别进行成脂、成骨和成肌诱导并以油红O、茜素红及免疫荧光染色进行鉴定。通过实时定量PCR和免疫荧光分别从mRNA水平和蛋白水平检测相关标志物、KLF2、KLF15和GLUT4的表达。结果体外培养的hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD29、CD90,并在特定诱导剂作用下能够定向分化为脂肪细胞、成骨细胞和成肌细胞,染色鉴定结果为阳性,并分别检测到相关标志基因的表达;hBMSCs成脂、成骨和成肌过程中KLF2、KLF15和GLUT4的表达均呈动态变化。结论 KLF2和KLF15与hBMSCs成脂、成骨和成肌分化的启动和维持有关;KLF2和KLF15可能通过GLUT4调节能量代谢从而影响hBMSCs定向分化。     

瘢痕疙瘩相关基因的生物信息学研究

目的用基因芯片及生物信息学的方法确定瘢痕疙瘩致病的相关基因,探讨瘢痕疙瘩发生的分子机理。方法利用含有人约22000个基因的长寡核苷酸芯片,检测5例具有遗传家族史的瘢痕疙瘩与正常皮肤成纤维细胞的基因差异性的表达情况,采用非监督聚类的等阶聚类方法(Hierarchicalclustering)发现统计学意义上差异表达的基因,GO(geneontology)确定这些基因所属的功能群体,探讨其在瘢痕疙瘩发生发展中的重要作用。结果生物信息学分析表明,在5例瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达趋势一致的上调基因有11个,下调基因有34个,其中与胶原代谢相关的差异表达基因数量最多。结论与正常皮肤成纤维细胞相比,瘢痕疙瘩发生过程中有多个基因的表达发生了明显地改变,其中代谢相关基因表达的改变可能在瘢痕疙瘩发生发展中发挥重要作用。     

不同来源的人脂肪干细胞体外成脂诱导分化能力的比较

目的:对同一个体不同部位来源的脂肪干细胞体外成脂诱导分化的能力进行比较,为脂肪干细胞的进一步应用提供实验依据。方法:实验于2004-11/2005-05在中国协和医科大学整形外科医院研究中心完成。提取5例女性临床吸脂患者(平均年龄32岁)8个部位(大腿前侧、臀上部;臀上部、上腹部;髂腰部;上腹部;背部、上臂)脂肪抽吸组织中的间充质干细胞,体外进行成脂诱导分化。在对照培养基(含体积分数0.1胎牛血清的DMEM培养基)中培养的第1代脂肪干细胞,以3×104细胞/皿接种到35mm培养皿中,将对照培养基更换为成脂诱导培养基,进行成脂诱导,每周换液2次,以加入对照培养基的培养皿设为阴性对照。继续培养2周,分别取诱导后的细胞和阴性对照细胞各两皿进行油红O染色,以证实细胞中有无脂滴形成。通过油红O染色及阳性细胞记数,分别对来源于3例患者的2个不同部位的脂肪抽吸标本中的脂肪干细胞向成脂细胞分化的能力进行定性和半定量检测,采用卡方检验对不同细胞的成脂诱导分化率进行测定。结果:①脂肪干细胞成脂诱导分化能力的测定结果:从不同个体的每100mL脂肪抽吸组织中提取的平均脂肪干细胞数目有所不同,从2.45×108个/100mL～1.25×109个/100mL不等;但从同一个体不同部位的脂肪中所获得的干细胞数目却比较近似;根据各例细胞成脂诱导分化率,可得出5例患者8个部位细胞的平均成脂诱导分化率为36.2%。经统计学分析证实同一个体不同部位来源的细胞具有不同的成脂分化能力,获得的平均干细胞数目与年龄无关(r=0.098,P=0.817),而细胞的成脂分化能力与年龄呈明显负相关(r=-0.568,P<0.01)。②成脂诱导后脂肪干细胞形态变化及油红O染色定性结果。脂肪干细胞经诱导后体积增大,分化为成脂细胞,细胞浆中可见许多大小不等的橙红色脂滴,多者可占整个细胞体积的80%～90%,细胞核缩小或偏于细胞的一侧,呈阳性;而在普通培养基中生长的对照细胞未见体积增大和脂滴形成,呈阴性。结论:患者年龄越大,成脂分化率越低,且同一患者不同部位来源的脂肪抽吸组织中的脂肪干细胞在成脂诱导分化能力上存在差异。提示利用脂肪干细胞进行相关实验时,在患者年龄和取材部位上应有所选择,进一步分析有可能找到获取脂肪干细胞的最佳部位。     

脱细胞异体真皮基质皮下移植后胶原的动态变化

目的　探讨脱细胞异体真皮基质 (ADM)移植后胶原的变化情况。方法　将异体ADM移植于SD鼠皮下 ,测定移植后ADM中胶原的含量及Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例。结果　异体ADM移植后胶原含量及Ⅰ、Ⅲ型胶原比例无明显变化。结论　异体ADM是一种良好的软组织填充材料。     

人骨髓间充质干细胞体外成骨与成脂分化过程中FGF1及其受体表达的变化

目的 研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨与成脂分化过程中成纤维细胞生长因子1(FGF1)及其受体(FGFRs)的动态表达,探讨FGF1在hBMSCs成骨与成脂分化过程中的作用.方法 密度梯度离心法分离hBMSCs,取第3代细胞分别进行成骨和成脂诱导分化并染色鉴定.通过real-time PCR方法检测成骨和成脂标志基因以及FGF1/FGFRs的表达,免疫荧光染色法检测诱导分化前后FGF1的表达.Real-time PCR及油红O染色鉴定外源性FGF1对hBMSCs成骨与成脂分化的影响.结果 体外诱导hBMSCs成骨和成脂分化后茜素红和油红O染色结果呈阳性;FGF1和FGFRs在诱导过程中呈动态表达;免疫荧光染色结果表明FGF1主要在细胞质中分布,成骨诱导3d后在细胞核中的表达增加;相比对照组,加入外源的FGF1组7d后脂滴数量明显减少,成脂标志基因表达受到抑制(P＜0.01),而加入外源的FGF1 3 d骨桥蛋白(OPN)表达升高(P＜0.05).结论 FGF1能够抑制hBMSCs的成脂分化,并且可能通过促进骨桥蛋白表达而提前hBMSCs的成骨矿化.