p38 MAPK对嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞共培养时细胞因子释放的调控作用

目的 了解嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞相互作用诱导细胞因子释放的p38 MAPK信号转导通路.方法 用CD16磁珠抗体分离外周血中嗜酸性粒细胞,以嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞(BEAS-2B)接触共培养为实验模型,观察SB 203580对细胞培养上清液中细胞因子浓度的影响.细胞因子浓度采用ELISA和流式细胞微珠方法测定.结果 SB 203580能够有效抑制BEAS-2B细胞释放IL-6、IL-8(P＜0.05)和嗜酸性粒细胞释放IL-8(P＜0.01).SB 203580对嗜酸性粒细胞与BEAS-2B细胞接触共培养诱导的IL-6、IL-8和IP-10释放具有显著抑制作用(P＜0.001).结论 嗜酸性粒细胞、BEAS-2B细胞单独或相互作用时均通过p38 MAPK信号转导通路释放细胞因子.     

细胞固定技术在两种细胞共同培养研究中的应用

目的探讨细胞固定对鉴别支气管上皮细胞和嗜酸粒细胞两种细胞共同培养过程中细胞代谢产物来源的作用及其机制。方法用1％多聚甲醛固定嗜酸粒细胞和支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞；通过锥虫蓝、伊红细胞染色，观察多聚甲醛固定对细胞形态、结构、活力和与正常细胞接触培养过程中与正常细胞黏附能力的影响；用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法定量分析固定细胞与正常细胞共同培养过程中对白细胞介素（IL）-6释放的影响。结果多聚甲醛固定后支气管上皮细胞和嗜酸粒细胞均变为死亡细胞，但其形态、结构及嗜酸粒细胞中颗粒着色无明显变化；多聚甲醛固定的BEAS-2B细胞与正常及固定的嗜酸粒细胞接触培养仅有极少量细胞发生黏附，而多聚甲醛固定的嗜酸粒细胞与正常BEAS-2B细胞接触培养则有较大数量的细胞发生黏附，但黏附细胞数量少于两种正常细胞的共同培养；固定后的嗜酸粒细胞与正常BEAS-2B细胞共同培养过程中可诱导BEAS-2B细胞释放IL-6。但与嗜酸粒细胞单独培养比较，固定后BEAS-2B细胞与正常嗜酸粒细胞共同培养对细胞培养上清液中IL-6浓度无明显影响。结论经多聚甲醛固定后，细胞死亡并丧失其代谢功能，但其表面仍保留可诱导其他细胞活化的结构成分，此技术可用于两种或多种细胞共同培养过程中代谢产物来源的鉴别。     

细胞固定在两种细胞联合培养研究中的应用

目的研究多聚甲醛固定于支气管上皮细胞和嗜酸性粒细胞,固定后细胞形态、结构,细胞与正常细胞共同培养过程中对细胞间粘附、活化,正常细胞释放细胞因子能力的影响,探讨细胞固定对鉴别两种细胞共同培养过程中细胞代谢产物来源的作用及其机制。方法用1%多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞;通过胎酚蓝、伊红细胞染色,观察多聚甲醛固定对细胞形态、结构、活力和与正常细胞接触培养过程中与正常细胞粘附能力的影响;用酶联免疫吸附试验(en-zyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)方法定量分析固定细胞与正常细胞共同培养过程中对白细胞介素-6(interlukin-6,IL-6)释放的影响。结果多聚甲醛固定后支气管上皮细胞和嗜酸性粒细胞均变为死亡细胞,但其形态、结构及嗜酸性粒细胞中颗粒着色无明显变化;多聚甲醛固定的BEAS-2B细胞与正常及固定的嗜酸性粒细胞接触培养仅有极少量细胞发生粘附,而多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞与正常BEAS-2B细胞接触培养则有较大数量的细胞发生粘附,但粘附细胞数量少于两种正常细胞的共同培养;固定后的嗜酸性粒细胞与正常BEAS-2B细胞共同培养过程中可诱导BEAS-2B细胞释放IL-6。但与嗜酸性粒细胞单独培养比较,固定后BEAS-2B细胞与正常嗜酸性粒细胞共同培养对细胞培养上清液中IL-6浓度无明显影响。结论经多聚甲醛固定后,细胞死亡并丧失其代谢功能,但其表面仍保留可诱导其他细胞活化的结构成份,此技术可用于两种或多种细胞共同培养过程中代谢产物来源的鉴别。     

嗜酸粒细胞对支气管上皮细胞表达细胞间黏附分子1的诱导作用

目的探讨嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞联合培养对支气管上皮细胞表达细胞间黏附分子(ICAM)-1的影响。方法人嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞(BEAS-2B)联合培养4和12h,提取BEAS-2B细胞总RNA;通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析与嗜酸粒细胞联合培养对BEAS-2B细胞中ICAM-1基因表达的影响;BEAS-2B细胞表面ICAM-1蛋白质的变化用荧光抗体流式细胞分析。结果经嗜酸粒细胞活化后,BEAS-2B细胞中ICAM-1基因表达上调;BEAS-2B细胞表面ICAM-1蛋白质量显著增加(34.23±4.19和57.60±7.62,P<0.05)。结论嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞接触培养可诱导支气管上皮细胞表达ICAM-1。     

脂多糖诱导外周血嗜酸粒细胞释放炎性细胞因子的探讨

目的：探讨脂多糖（LPS）对嗜酸粒细胞释放炎性细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。方法：嗜酸粒细胞用CD16抗体磁珠方法从人新鲜外周血中分离;分别进行5×10^5／ml嗜酸粒细胞的单独培养和与LPS（1ug／ml）共培养18h;应用流式细胞小球微阵列（cytometric bead array,CBA）方法定量测定细胞培养上清液中细胞因子含量。结果：从外周血中新分离的嗜酸粒细胞单独培养过程中没有或仅有极少量上述炎性细胞因子释放,但新分离的嗜酸性粒细胞与LPS共培养18h后,其培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α大量增加（P均〈0．001）,而IL-2、IL-4、IL,12和IFN-γ的含量无明显变化。结论：LPS对嗜酸粒细胞释放炎性细胞因子具有很强的选择性诱导作用。     

嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放IL-6

目的：探讨嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞后对其细胞因子白细胞介素（IL）-6分泌的影响。方法：正常和1％多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞分别与支气管上皮细胞（BEAS-2B）细胞联合培养，应用流式细胞微珠实验（CBA）方法定量细胞培养上清液中细胞因子的浓度，用RT-PCR方法分析经嗜酸性粒细胞活化后支气管上皮细胞中IL-6的基因表达。结果：经嗜酸性粒细胞活化后，支气管上皮细皮中IL-6基因表达显著上调，细胞培养上清液中IL-6蛋白质浓度升高，多聚甲醛固定后的嗜酸性粒细胞能够刺激支气管上皮细胞中IL-6基因表达和蛋白质释放。结论：嗜酸性粒细胞可活化支气管上皮细胞中IL-6基因表达和促进其蛋白质分泌。     

TNF-α诱导支气管上皮细胞表达ICAM-1

目的：探讨支气管上皮细胞活化对ICAM-1基因和细胞表面ICAM-1蛋白质表达的影响。方法：用10ng／ml TNF-α作用于正常培养的支气管上皮细胞（BEAS-2B）12h，通过RT-PCR分析ICAM-1在BEAS-2B细胞中的基因表达和用流式细胞仪分析ICAM-1在BEAS-2B细胞表面蛋白质量。结果：TNF-α与BEAS-2B细胞共同培养12h。可上调BEAS-2B细胞ICAM-1基因的表达和增加BEAS-2B细胞表面的ICAM-1蛋白质量。结论：TNF-α可诱导BEAS-2B细胞ICAM-1基因和蛋白质表达。     

基因芯片用于活化支气管上皮细胞基因表达的研究

目的探讨基因芯片筛选肿瘤坏死因子(TNF)-α活化后支气管上皮细胞基因表达的变化。方法提取支气管上皮细胞系(BEAS-2B细胞)总RNA,用基因芯片检测正常培养和经TNF-α活化的BEAS-2B细胞基因表达,对上调表达的基因用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)确证,用流式细胞微珠方法(CBA)检测TNF-α活化的BEAS-2B细胞培养液中相关细胞因子浓度。结果TNF-α活化后BEAS-2B细胞中细胞间黏附分子(ICAM)-1、白细胞介素(IL)-8、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、TNF-α、IL-6基因表达显著上调(分别上调6·5、8·2、3·1、4·9和3·5倍),表达上调的基因用RT-PCR确证结果基本一致。TNF-α活化后BEAS-2B细胞培养液中细胞因子的分泌(BEAS-2B细胞培养过程中有、无TNF-α存在,IL-6、IL-8和MCP-1的分泌分别为:(117·83±18·20)ng/L和(1771·33±312·67)ng/L,P<0·001;(277·97±50·76)ng/L和(7579·20±797·15)ng/L,P<0·001;(741·53±129·91)ng/L和(12228·57±1897·58)ng/L,P<0·001),与相应基因的表达一致。结论用基因芯片方法筛选活化后支气管上皮细胞基因表达对研究支气管上皮在气道性疾病中的作用具有重要意义。     

嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞中p38 MAPK信号转导通路的活化作用观察

目的探讨嗜酸性粒细胞在与支气管上皮细胞接触共培养过程中对后者炎性介质释放的影响。方法用CD16抗体磁珠法分离嗜酸性粒细胞,免疫印迹(Western blotting)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管上皮细胞中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、激活转录因子(ATF)-2蛋白含量,微珠免疫沉淀结合免疫印迹法检测p38MAPK活性。结果经与嗜酸性粒细胞共同培养活化后,支气管上皮细胞中磷酸化p38MAPK蛋白含量及其活性均显著上升,p38MAPK信号转导通路链中下级底物蛋白质ATF-2(细胞内调控某些基因表达的转录因子)量也显著上升;多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞同样可以活化支气管上皮细胞,增加其细胞内p38MAPK蛋白质磷酸化。p38MAPK酶选择性抑制剂SB203580可有效抑制p38MAPK诱导其底物ATF-2磷酸化。结论嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞接触共培养过程中对炎性介质表达和释放的调控作用可能是通过活化支气管上皮细胞内p38MAPK信号传导通路未实现的。